基因工程—诞生原理技术应用.ppt

* 专题一 基因工程 高考考纲要求: （1）基因工程的诞生 Ⅰ （2）基因工程的原理及技术 Ⅱ （3）基因工程的应用 Ⅱ （4）蛋白质工程 Ⅰ 实验：DNA的粗提取与鉴定 专题一 基因工程 一、基因工程的定义 按照人们的意愿， 把一种生物的某种基因提取出来， 加以修饰改造， 然后放到另一种生物的细胞里， 定向地改造生物的遗传性状。 供体生物 目的基因 剪切和拼接，建构重组DNA分子 受体细胞 也称基因拼接技术或DNA重组技术 二、基因工程的理论依据 DNA是绝大多数生物的遗传物质，不同生物的DNA的基本单位和结构相同 中心法则： DNA RNA 蛋白质 复制 转录 翻译 逆转录 复制 基因是遗传物质结构和功能的基本单位 各种生物共用一套遗传密码 三、DNA重组技术的基本工具 1、限制性核酸内切酶——分子手术刀 来源： 主要从原核生物中分离提纯 特点： 高度的专一性 多样性 识别并切割特定的某种核苷酸序列 已经分离出4000种 作用： 识别双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列， 含有4～8个核苷酸 中心轴线两侧的碱基反向对称重复排列 如EcoRⅠ酶，从中轴线两侧切开， 如Sma Ⅰ酶，沿中轴线处切开， 平切： 错位切： 形成平末端 形成黏性末端 并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 2、DNA连接酶——“分子缝合针” 将双链DNA分子的两个片段连接起来 ——通过形成磷酸二酯键 E.coli DNA连接酶： 连接黏性末端 T4DNA连接酶： 连接黏性末端或平末端 DNA连接酶与DNA聚合酶功能的区别： DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键而连接起来 DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键而连接起来 3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 作用： 将目的基因（外源基因）送入受体细胞 条件： 有一个或多个限制酶切割位点 在受体细胞中能自我复制，或者能整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制 带有标记基因，便于甄别和筛选 安全，对受体细胞无害 大小合适，方便操作 种类： 质粒（经人工改造，常用）、 λ噬菌体衍生物、动植物病毒、农杆菌等 四、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 ⑴从基因组文库中获取目的基因 将某生物的基因组进行切割，获得一批长度为15—20kb的DNA片段 将上述DNA片段分别与运载体结合，再分别导入受体菌群体的各细胞中储存、复制 需要时通过一定方法从基因组文库中获取目的基因 ——构建成该生物的基因组文库 限制酶 ⑵利用反转录法获取目的基因 单链DNA（ cDNA ） 提取某生物细胞中的mRNA 反转录酶 DNA聚合酶 双链DNA 受体菌细胞中储存、复制，建构cDNA文库 PCR技术扩增 获取目的基因 一定方法 导入 RNA—DNA杂交分子 RNA酶降解RNA链 ⑶直接提取后利用PCR技术扩增而获取目的基因 以探针从生物细胞中提取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 ⑷人工合成目的基因 DNA合成仪合成双链DNA（目的基因） 碱基序列已知 测定某蛋白质中氨基酸的排列顺序 利用密码子表推测 mRNA中碱基排列顺序 DNA反义链的碱基排列顺序 利用碱基互补配对原则推测 化学合成 真核生物的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 外显子 内含子 初级mRNA 翻译 蛋白质 启动子 终止子 转录 加工 成熟mRNA PCR技术（聚合酶链式反应） ——人工扩增DNA技术 引物 原理： DNA的半保留复制 反应系统： 微量DNA样品 DNA聚合酶 4种游离的脱氧核糖核苷酸 ——模板 ——dATP、dTTP、dGTP、dCTP ——人工合成的含有20个碱基 的核苷酸序列 （过量） （过量） 退火（55 ～60℃ ）, 与引物互补 在适宜温度下（70～75℃）形成DNA新链 反应过程 样本DNA DNA聚合酶 引物 提高温度（90～95℃）,DNA变性 循环进行 DNA数量呈指数方式增加 PCR技术与体内DNA复制的区别： 1. PCR不需要DNA解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR一般可以经历三十多次循环，短时间内形成大量DNA片段；而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制，形成整个DNA分子。 2、基因表达载体的构建 一个基因表达载体包括： 启动子 目的基因 终止子 标记基因 其他 ——RNA聚合酶的识别和结合位点， 驱动基因转录 ——使受体生物表现