Ⅰ型超敏应的细胞分子机制及其抗炎蛋白质的分析.docxVIP

型超敏反应的细胞分子机制及其抗炎蛋白质的研究摘 型超敏反应的细胞分子机制及其抗炎蛋白质的研究 摘 要 目的： 1)从细胞分子水平研究I型超敏反应的免疫病理发生机制。 2)通过基因克隆策略和分子生物学技术从人的Daudi 细胞中获得含人磷脂酶D2的功能保守基序的基因， 并使其在大肠杆菌中表达，最终室到具有生物学活性 的蛋白质产品：rhPLD2。 3)研究该蛋白在哮喘等I型超敏反应的炎症过程中所具有 的一系列免疫学生物活性。 方法： 1)采用微量免疫荧光、免疫酶标、细胞培养、电镜等技 术观察当肥大细胞受到相同过敏原再次刺激时释放炎症介质 的过程。并将抗原、抗体结合的高特异性与DAB、中性红染 色的高灵敏性相结合，测定肥大细胞被IgE致敏的百分率。 2)Daudi细胞经5％C02，37。C条件下，以20％dx牛血清、 100p．g·ml。1链霉素、100 U·ml“青霉素的DMEM培养基培养， 调整细胞密度达10陀个·ml～。经1,500 rpm，5 min离心， 收集沉淀细胞。 3)提取mRNA，并根据所设计5’和3’端寡核苷酸引物及突变 引物进行RT—PCR。 摘要 摘要 I型超敏反应的绷胞分子机制及其抗炎蛋白质的研究 4)PCR产物采用基因内引物PCR扩增和基因内限制性内切酶酶切方 法进行分析鉴定正确后，克隆到载体pUCm—Tvector／pSK上。酶切， PCR及测序鉴定其正确性。将rhPLD2的DNA全长片段克隆至原 核表达载体pET30a(+)q，，构建出能表达出带有6×His纯化标记的 pET30a—rhPLD2的融合蛋白的原核表达载体。所获重组蛋白经分 离、纯化，SDS—PAGE，Western Blot鉴定分子量和纯度。并采用BCA Protein Assay Reagent Kit测定其蛋白含量。 5) 参照Amplex Red Phospholipase D Assay Kit提供的Protocol进行人重 组磷脂酶D2蛋白质的活性测定。 6)蛋白质产品rhPLD2进行动物过敏实验和毒性实验。利用速发 型超敏反应的动物模型，在体外抗炎实验的基础上进一步研 究用药前后，实验动物临床症状的表现及动物循环血液中嗜 酸性粒细胞(Eos)的水平。 6) 观察rhPLD2对LPS诱导小胶质细胞释放炎症因子的干预作用。 结果： 1)观察到了MC特异性脱颗粒的过程，并实拍到了其动态变化。 2)建立了哮喘监测、诊疗的新指标。3)从人Daudi细胞中提取 mRNA，经剪切、拼接变构，克隆获得了不含膜结合部位及信号肽 的，可编码631个氨基酸的PLD2 cDNA序列(GenBank登录 号：AYl78289)。4)构建了不含信号肽及氨基端的rhPLD2的E．co“ 工程菌株的表达载体，在细菌细胞的包涵体中成功获得了 型超敏反应的细胞分于机制及其抗炎班白质的研究 型超敏反应的细胞分于机制及其抗炎班白质的研究 摘要 膜蛋白的表达产物：rhPLD2的变构蛋白质，且具有较好的生物活性：与提 取的天然膜蛋白及纯化的PLD标准(Sigma)比较，rhPLD2具有较好的 生物活性：达到47．982 mU／mL(0．9075mg／mL)(rhPLD2第一批)；53．967 mU／mL(0．93493mg／mL)(rhPLD2第-}Lt)。5) 已成功建立了稳定的哮 喘动物模型。荠初步进行了rhPLD2的动物过敏试验，表明：rhPLD2经腹 腔注射0．4537 mg／mL及1．815mg／mL，对动物无致敏及任何毒性作用。6) rhPLD2对动物模型的哮喘状态有一定的拮抗作用。用药前后其Eos的水 平经t检验比较P0．01，差异具有显著性。7)初步证实了rhPLD2对 LPS诱导小胶质细胞释放炎症因子有抑制性的干预作用。 结论： 1) 特异性释放颗粒时，肥大细胞(MC)内有曲折的膜被迷路 或脱颗粒管道形成，并与细胞膜合并形成开口，胞浆颗粒由此释放 到细胞外。颗粒被释放后，膜性开口重新闭合。脱颗粒后的MC 胞浆内空泡化明显，电子密度明显降低2) 肥大细胞特异性脱颗 粒可被DAB加中性红双染色法染色。其优点是：不受肥大细胞自 然脱颗粒(非特异性脱颗粒)的影响。即特异性高，灵敏度好。3) rhPLD2的变构蛋白质，是一个具有生物学活性及一定免疫学活性的 功能蛋白质。4)rhPLD2可在大肠杆菌中得到较好的活性表达。5) rhPLD2在炎症过程中发挥着重要的抗感染作用。 摘要 摘要 型超敏反应的细胞分予机制及其抗炎伍臼质的研究 关键词： 人重组磷脂酶D2(rhPLD2)； 变构蛋白质： 抗感染； 活 一性。 博士生：朱玲 导师： 陆惠民 黄瑞 苏东辉 黄伟达 !型塑墼垦生!!型些坌王坐型墨苎堕壅笙宴璺塑型空一．一————————