fats表达调控及其抑制p21蛋白降解的制分析.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 人沣陕科人。学硕fj学化论文 中文摘要 目的 通过在全基因组规模上采用微阵列．比较基因组杂交(array-CGH)技术分析 小鼠肿瘤细胞染色体基因的拷贝数变化，本课题组在固际上首次发现一个新的 并且进化上保守的抑痛基因，并命名为FATS(fragile．site associated tumor suppressor)。进一步通过筛选小鼠睾丸cDNA表达文库，本课题组在国际上首次 发现一个新的FATS mRNA表达转录变异体(Genbank收录号：GQ499374)。初 步研究证实FATS抑制去乙酰化酶1(HDACl)结合细胞周期抑制性因子p21蛋 白，并增强p21蛋白的乙酰化修饰和稳定性。本研究的目的是要进一步阐明FATS 基因表达的调控规律，并研究p21蛋白乙酰化修饰和其蛋白稳定性的有机联系。 方法 1．生物信息学分析表明FATS基因启动子区域存在p53抑癌转录因子的结合基 序。]羽PCR技术扩增FATS基因启动子区域中含潜在p53结合位点的目的片段 (约746kb)，并构建受FATS基因启动子调控的荧光素酶报告基因载体 (746．Lue)，将746．Luc单独转染或与p53共转染U87细胞(p53野生型)，接 着用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)检测转染细胞中的荧光 素酶活性，确定p53对FATS基因启动子的调控作用。 2．用染色质免疫沉淀方法检测U87细胞中R玎S基因启动子DNA特异性结合p53 转录因子的情况，验i正FATS基因表达受p53调控。 3．对FATS基因启动子中p53结合基序的关键碱基实施定点突变，构建突变位 点报告基因载体M．746．Luc，将746．Luc和M．746．Luc分别单独转染或与p53 共转染细胞，用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)检测转染细 胞中的荧光素酶活性，进一步分析p53结合顺式元件的特异性突变对FATS 启动子转录活性的影响。 4．利用p53应答DNA损伤反应的特性，用Etoposide处理U87细胞诱导DNA 损伤，接着用Western blot方法检测细胞中FATS基因表达水平，以未被药 物处理的细胞为对照，分析DNA损伤状态下细胞中FATS基因的转录水平。 5．将GST-C8融合表达载体转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导，纯化GST-C8蛋  天津陕科人学硕十·学位论文 白，用于蛋白质相互作用研究。 6．用化学合成法合成乙酰化和未乙酰化的p21 C．端蛋白多肽，进行GST pull．down实验，确定p21乙酰化对其蛋白质稳定性的影响。 7．分析去乙酰化酶抑制剂TSA对细胞中p21蛋白表达水平的影响。 争±甲：日木 1．与单独转染746．Luc的细胞相比，共转染746．Lue和p53的U87细胞(p53野生 型)中荧光素酶活性显著增强。 2．FATS基因启动子DNA能与p53转录因子发生特异性结合。 3．对FATS基因启动子中p53结合基序的关键碱基实施定点突变，其调控荧光 素酶报告基因的活性显著下降。 4． 与未被药物处理的对照细胞相比，用Etoposide处理U87细胞诱导DNA损 伤后，细胞中FATS基因表达水平明显升高。 5．GST pull—down实验结果显示：纯化的GST．C8蛋白能结合未被乙酰化修饰 的p21蛋白C．端结构域，而p21蛋白的乙酰化修饰能显著抑制C8．p21蛋白 质相互作用。 ． 6．用去乙酰化酶抑制剂TSA处理细胞后，细胞中p21蛋白的表达水平明显增 高。 结论 1．FATS是一个新的p53转录调控靶基因。 2．FATS基因启动子中p53结合基序发生位点特异性突变后，p53对FATS启 动子的转录活性大大减弱。 3．DNA损伤后细胞中FATS基因的转录水平升高，进一步证实p53对FATS基 因的表达调控作用。 4．p21蛋白的乙酰化修饰对其蛋白的稳定性具有重要作用。 关键词：p53应答元件p21 FATS定点突变DNA损伤 乙酰化  大津医科人学硕}=学位论文 Abstract 0b iect i ve Through Genome-wide dissection of mouse tumor genome using microarray -based comparative genomic hybridization(array-CGH)，we have identified a previously uncharacterized gene and named it FATS(for Fragile-site Associated Tumor Suppressor)．Furthermore，we identified a novel transcript