ebvmirbhrf11通过抑制p53调节鼻咽癌细胞中ebv感染状态的分子制分析.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 摘要 miRNA(microRNA)是近年来发现的一类长约22nt的非编码小 RNA分子。在胞浆内与特定蛋白形成微核酸蛋白复合体(miRNPs， micro-ribonucleouproteins)，通过对靶基因mRNA的序列特异性裂解、 抑制翻译的起始或延长、降解多聚腺苷酸尾或者介导肽链水解等机制 在翻译水平抑制其靶基因的表达。但是，人们对miRNA在形成蛋白 复合体并靶向调节基因的过程中的具体机制，仍然知之甚少。miRNAs 广泛存在于从病毒到高等多细胞生物，目前采用生物信息学预测，在 低等多细胞动物和植物中存在一两百条miRNAs，而在人类可能存在 至少一千条。对miRNAs功能的研究提示几乎参与所有细胞内进程的 调节，在包括肿瘤在内的人类所有病理过程中都能观察到其表达的异 常。这一发现与生物信息学所预测的，哺乳动物中约30％蛋白编码基 因受到miRNAs的调节相一致。 病毒在感染宿主细胞后，需要调节自身和宿主两方面的基因表 达，使其自身存在得以维持和复制，潜伏感染以维持自身存在，部分 进入复制周期以使自身繁殖扩增，两者之间的平衡，避免了自身过多 复制引起宿主细胞的死亡。这种平衡对病毒来说很重要。多数病毒也 能编码miRNAs并广泛参与病毒与宿主的相互作用。EB病毒是人类 疱疹病毒，与包括鼻咽癌在内的多种人类疾病密切相关。该病毒目前 发现编码至少32条miRNAs，据其在基因组中的位置分为两组： BHRFl组和BART组。其中BHRFl组位于病毒复制早期基因BHRFl 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 内，BART组则位于病毒潜伏期转录产物BART内。BART组miRNA 已证实可以抑制病毒复制，维持其较低的复制水平。BHRFl组在病 毒裂解复制水平增高时表达增加，提示其与病毒裂解复制的调控相 关。但是，生物信息学分析并没有发现BHRFl组miRNA在病毒裂 解复制期基因中存在作用位点，只有ebv．miR．BHRFl．1在人p53 mRNA 3’．非编码区(3’．UTR，3-Untranslated regions)存在两个作用 靶位点。 P53是重要的抑癌基因，在多种肿瘤中存在突变。但是，在鼻咽 癌中p53基因的突变频率很低(10％)，并出现了p53蛋白积聚现象。 作为调节细胞周期进程和细胞凋亡的重要基因，多数病毒在宿主细胞 内进行自身复制时，需要通过不同的途径来抑制p53的功能，来使宿 主细胞内环境处于类S期，并抑制细胞的凋亡，为病毒自身复制提供 原料和赢得时间。而且研究发现，EB病毒裂解复制立刻早期基因蛋 白Zta，作为病毒裂解复制的开关基因，在病毒进入裂解复制周期时 可以和p53结合，抑制其转录激活功能。说明EB病毒在复制过程中 同样需要抑制p53的功能以为其自身复制提供有利条件。那么野生型 p53蛋白在鼻咽癌中的积聚，可能在鼻咽癌中EB病毒低水平复制的 维持中具有重要意义。 由此，我们推测：EBV编码的ebv．miR．BHRFl．1可能通过调节 宿主细胞相关基因p53的表达，进而调节p53与Zta相互作用而参 与调节EBV潜伏与裂解两种状态的转换。 Il 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 我们采用TPA诱导SUNEl内病毒裂解复制水平增高后，采用 RT-PCR方法证实在病毒裂解复制水平增高后，ebv—miR-BHRFl．1的 表达也随之上调，而p53蛋白水平和下游基因mdm2水平随之下调， 同时细胞周期检测证实S期细胞增加而凋亡细胞减少， ebv．miR-BHRFl．1的上调与p53的下调及功能受抑有利于病毒复制， 且两者之间存在联系。 然后，我们采用反义RNA特异性抑制ebv．miR-BRHRFl．1之后， 再以TPA处理SUNEl，发现病毒裂解复制早期蛋白Zta和Ea．D上调 幅度减小，说明裂解复制水平提高的幅度减小，而p53蛋白水平和 mdm2水平的下调也减弱，mdm2水平甚至得到逆转，说明p53功能 的受抑制程度也得到了逆转。 接下来，我们构建ebv．miR．BHRFl．1的过表达载体，转染SUNEl 细胞，观察GFP蛋白表达证实转染效率，以RT-PCR检测证实成熟 ebv．miR-BHRFl．1得到表达，再检测病毒复制早期蛋白Zta和Ea．D 水平以及p53蛋白和mdm2蛋白水平，比较对病毒复制水平的影响和 对p53的抑制作用。发现在过表达ebv．miR-BHRFl．1后，病毒裂解 复制水平提高而p53蛋白水平和功能受到了抑制。 以上研究结果表明， EB病毒编码的miR-BHRFl．1通过调节宿 主细胞相关基因p53的表达参与病毒裂解复制的调节，初步阐明EBV 编码的miR．BHRFl．1参与调节EBV两种感染状态的