大肠杆菌蛋白表达感受态细胞制备.PDFVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 大肠杆菌蛋白表达感受态细胞的制备 感受态细胞的概念 感受态 ，是指宿主细胞最容易接受外源基因并实现将其转化的一种生理状态 ，它是由受体菌的遗传性状所决定 2+ 的 ，同时也受菌龄以及外界环境因子的影响 ，比如 Ca 就可以大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对 数生长期 ，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 感受态细胞制备的原理 制备感受态细胞最常用的方法是用预冷的 CaCl 处理对数生长期的细菌 ，即用低渗 CaCl 溶液在低温 （0℃ ） 2 2 时处理快速生长 （进入对数生长期 ）的细菌 ，从而获得感受态细胞。此时细胞膨胀成球形 ，外源 DNA 分子在低温 条件下易形成抗 DNA 酶的羟基 －钙磷酸复合物粘附在细胞表面 ，通过热激处理促进细胞对外源 DNA 分子的吸收。 转化效率非常高。此方法的关键在于选用的细胞必须处于对数生长期 ，实验操作必须在低温无菌环境下进行。 大肠杆菌感受态细胞的制备实验 1、实验仪器及试剂 仪器 ：超净工作台 ，摇床 ，高压灭菌锅 ，培养箱 ，制冰机 ，超低温冰箱 ，离心机 ，接种环 ，试管 ，摇瓶 （2L ）， 平板 ，移液枪 ，枪头 ，离心管 （500mL ）,EP管 （1.5mL ）,蓝盖瓶 ，泡沫箱 试剂 ：CaCl 溶液 ：PIPES 1.51g ，CaCl •2H O 4.41g ，甘油 75ml ，pH=7.0 ，定容至 500ml。 2 2 2 LB培养基 （固体、液体 ）：Tryptone 1.00g ，Yeast 0.50g ，NaCl 1.00g ，定容至 100ml。（固体培养基加入 1.5% 的琼脂 ） 抗性 ：卡那霉素 ，氨卞青霉素 ，氯霉素 ，四环素。  材料 ：感受态菌株 2、 实验方法及操作步骤  取 －80℃冻存的感受态菌株 ，用接种环划线分离接种于固体平板上 （平板抗性根据感受态选择 ），做好标 记 ，倒置于 37℃培养箱培养过夜。 Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB （ ） 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions  第二天 ，从平板上挑取单个菌落 ，接种至含有 4ml LB培养液 （抗性根据感受态选择 ）的试管中 ，37℃ ， 195rpm ，震荡培养过夜。次日取菌液 4ml接种至含有 400ml LB培养基 （抗性根据感受态选择 ）的 2L摇 瓶中 ，37℃ ，200rpm震荡培养约 2-3小时。  当菌落 OD600nm值达到0.3 －0.5时 ，将摇瓶取出放置于冰上 10-15min。在无菌条件下把菌液倒入 500ml 的预冷的离心管中 ，离心 4℃,3000r ，8min。  弃去上清 ，加入约 200ml 的预冷的 CaCl 溶液 ，吹打混匀 ，悬浮菌体 ，放入冰浴 30min。 2  离心 4℃ ，3000r ，8min ，弃去上清 ，加入约 8ml预冷的 CaCl2溶液 ，重新悬浮菌体。  将用 CaCl 溶液处理后的菌体分装于 1.5ml 的 EP管中 ，每管 110ul ，保存于-80℃的超低温冰箱中。 2 感受态细胞