第十四章免疫三标记技术.pptVIP

第十四章 免疫标记技术 免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应； 并借助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定； 可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究； 免疫标记技术 在应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。 因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。 免疫标记技术的分类 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为： 免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 发光免疫测定。 免疫标记技术的应用范围 近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。 各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。 在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验上作中应用十分广泛。 良好的分析试剂所具备的条件 高度选择性：决定分析结果的可靠性，同时省略预分离过程； 高亲合性：保证分析数据的精密度和分析结果的准确性，也是达到高灵敏分析的基础； 高灵敏性：试剂与分析络合物之间应有较大的信号反差 特异性和亲合性是免疫分析的基础 抗体作为分析试剂其特异性和亲合性是无与伦比的，在免疫分析中样品不需要或只要简单的预处理即可直接进行反应 抗体-抗原复合物的亲和常数(Ka)一般为109 mol-1，有些可达1014-15 mol-1，并且有较高的稳定性 这两点是奠定免疫分析的 高灵敏度和高度专一的基础。 免疫标记技术的必要性 然而抗体却缺乏高灵敏性试剂所应具备的分析信号反差，为了解决这一问题，人们研究发展了标记免疫分析法，在分析体系中引入探针系统实现高灵敏度检测 ，这就是抗体的标记技术（免疫标记技术）。 第一节 免疫荧光标记技术 免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)始创于40年代初，1942年Coons等曾次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶件肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。 直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。 基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性同显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。 然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。 荧光抗体染色方法 荧光及荧光素 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光，停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。 目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。 荧光抗体染色方法（直接法） 直接法是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。 此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。 荧光抗体染色方法（间接法） 将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去末结合的抗体。 滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体己发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。 此法的优点是敏感性高于直接法，而且只需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。 荧光抗体染色方法（间接法） 亦可用荧光束标记葡萄球菌A蛋白，代替标记抗球蛋白抗体用于间接法荧光染色。且不受第一抗体来源的种局限制，但敏感性低于标记抗抗体法。 间接法有时易产生非特异性荧光，为其缺点。 此法常用于各种自身抗体的检测。 如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗原。 第二节 放射免疫标记技术 放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA)是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。 放射免疫标