hTERT启动子的克隆及其启动效率分析.docxVIP

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的：克隆人端粒酶逆转录酶启动子片段，并证明hTERT启动子可以引导目的基 因在肿瘤细胞中表达。 方法：使用RT-PCR和荧光定量PCR检测多种肿瘤细胞及正常细胞中的hTERT 表达活性；Western Blot检测hTERT在多种肿瘤细胞中的蛋白表达；通过PCR 及pMD．18T质粒载体对hTERT核心启动子进行扩增和克隆；以pGL3．Basic为 载体构建含hTERT启动子和hNIS基因的重组质粒，并通过荧光素酶活性实验 检测hTERT启动子在不同细胞中的启动效率 结果：1、RT-PCR的结果显示在H460、U251、U87、ARO及FRO等细胞中均 存在hTERT mRNA的表达，只是活性的高低不一；而在正常细胞MRC．5中无 表达。荧光定量PCR的结果显示在胶质瘤细胞U251内存在hTERT的高活性表 达，与内参基因9-actin对照，其相对含量为0．1 8％。 2、Western Blot结果显示在120 kD处可见阳性反应条带，为表达的hTERT目的 蛋白。 3、成功构建并鉴定了含3种不同长度hTERT启动子序列(260 bp、456 bp及1453 bp)pMD-18T和pGL3重组质粒，并成功构建并鉴定了含260 bp hTERT启动子 及hNIS基因的重组质粒pGL3．204．hNIS。 4、荧光素酶活性实验结果显示，在上述肿瘤细胞中，3种hTERT启动子片段均可 诱导荧光蛋白的表达，但其启动效率存在差异，其中pGL3．204中的启动子片段 (260 bp)在FRO、H460、U251和U87中启动效率最强，可以达到SV40启动子 的80％。 结论：在多种肿瘤细胞中均存在hTERT不同活性的表达，因此可以应用hTERT 启动子引导治疗基因在多种肿瘤细胞中的特异性表达。而且hTERT核心启动子 具有较高的启动效率，可以替代全长启动子引导hNIS基因表达。 关键词：hTERT启动子端粒酶重组质粒基因治疗靶向性 天津医科大学硕士学位论文Abstract 天津医科大学硕士学位论文 Abstract Ob iectives We cloned the hTERT promoter into the pGL3 Vector,resulting in the expression of fluorescent proteins only in telomerase positive cancer cells． Methods We uesd RT-PCR and real-time fluorescent quantitative PCR口Q-PER,or qPCR)to detect the expression of the hTERT and}∞tin genes in some tumor cell lines and a normal cell line,tested the protein expressing of the hTERT and p．actin genes by Western-Blotting,amplified and cloned the hTERT gore promoter by PCR and inserted into pGL3·Basic vectors，constructed the hTERT promoter recombinant plasmids，detected transcriptional activities of hTERT珊omoter in cell lines by measuring the luciferase activities． Results 1．The RT-PCR showed the expressions of the hTERT mRNA existed in H460，U25 1， U87，ARO and FRO cells，yet the levels of transmptional activities were different． But the expression of the hTERT mRNA was do not found in the MRC-5(normal cell)． The FQ-PCR showed the expression of the hTERT gene Was very high in U25 1 cells， and the relative concentrations Was 0．1 8％compared witll 13-actin(internal reference)． 2．Western