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第八章 生物信息学在基因芯片中的应用 主讲人：孙 啸 制作人：刘志华 东南大学 吴健雄实验室 生物信息学和基因芯片是生命科学研究领域中的两种新方法和新技术，生物信息学与基因芯片密切相关，生物信息学促进了基因芯片的研究与应用，而基因芯片则丰富了生物信息学的研究内容 第一节 概述 １、基因芯片简介 （１）基因芯片的基本原理及生物信息学的作用 基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。 基因芯片把大量已知序列探针集成在同一个基片上，经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交,便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。 根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。 其中一类是较长的DNA探针（?100mer）芯片 这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。 另一类是短的寡核苷酸探针芯片 其探针长度为25 mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。  （２）基因芯片制备 基因芯片的制备主要有两种基本方法: 一是在片合成法， 在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。 另一种方法是点样法。 基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。 （３）靶基因样品的制备及芯片杂交 根据基因芯片的检测目的不同,可以把样品制备方法分为 用于表达谱测量的mRNA样品制备 用于多态性(或突变)研究的基因样品的制备 （４）杂交信号检测 对于用荧光素标记经扩增（也可用其他放大技术）的序列或样品，与芯片上的探针进行杂交，然后冲洗，采集荧光图像。 图像的采集用落射荧光显微镜 或电荷偶联装置照相机 非共聚焦激光扫描仪等进行。 ２、基因芯片对于生物分子信息检测的作用和意义 在生命科学领域中，基因芯片为分子生物学、生物医学等研究提供了强有力的手段。 利用基因芯片技术，可研究生命体系中不同部位、不同生长发育阶段的基因表达，比较不同个体或物种之间的基因表达，比较正常和疾病状态下基因及其表达的差异。 基因芯片技术也有助于研究不同层次的多基因协同作用的生命过程，发现新的基因功能，研究生物体在进化、发育、遗传过程中的规律。 ３、基因芯片研究和应用中所涉及到的生物信息学问题 （２）生物信息学在基因芯片中的应用 生物信息学在基因芯片中的应用主要体现在三个方面: 确定芯片检测目标 芯片设计 实验数据管理与分析 （３）基因芯片研究与应用中所要解决的信息学问题 在基因芯片信息学方面要解决以下几个关键的问题: 第一是芯片设计问题 第二是可靠性分析问题 第三是数据挖掘问题 第二节 基因芯片设计 １、基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: (1)探针的设计 指如何选择芯片上的探针 (2)探针在芯片上的布局 指如何将探针排布在芯片上。 确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 数据库搜索 得到关于序列突变的信息及其它信息。 在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性 ２、DNA变异检测型芯片与基因表达型芯片的设计 对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测出发生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。 从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配出现在探针中心时，辨别能力强，而当错配出现在探针两端时，辨别能力非常弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。 ３、cDNA芯片与寡核苷酸芯片的设计 cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息的利用以及各种文库的建立。 cDNA芯片制备方法一般采用点样法，多用于基因表达的监控和分析。 寡核苷酸芯片制备一般采用在片合成方法。优化是寡核苷酸芯片设计的一个重要环节，包括探针的优化和整个芯片设计结果的优化。 ４、寡核苷酸探针的优化设计 ５、基因芯片布局 ５、基因芯片布局 凸点均匀分布布局方法 ６、基因芯片优化 高密度寡核苷酸芯片设