miRNA审审23a在2C12细胞成肌分化过程中的调节作用研究.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 脊椎动物的肌肉分化受多种转录因子的复杂的网络调控，目前，研究发现很 多基因，包括生长因子、调节蛋白、受体以及转录因子都参与了肌分化的调节。 多条信号通路也可以正向或负向调节肌分化。近年的研究发现，microRNA (miRNA)对肌肉发育进行精细的调节，是调节肌肉分化发育的一个新层次。 miRNA是一类小非编码RNA，大小约22nt，在转录后水平调节基因的表达。 已经发现的miRNA主要调节肌肉分化发育的中间过程，例如miR-133、miR．206 和miR-214等。本文通过生物信息学分析，发现成体动物骨骼肌的重要结构和功 能蛋白一三种快肌肌球蛋白重链(myosin heavy chflJil，Myhl，Myh2，Myh4)mRNA 的3’-UTR存在一种miRNA．23a结合序列。我们据此进行了以下研究： 一、 首先构建了miRNA．23a的真核表达载体pIRES2。EGFP．miRNA-23a， 在pGL．3．promoter萤光素酶基因的3’端插入此三种靶基因mRNA的3’-UTR 的mRNA结合序列。二者共同转染HEK293细胞，结果发现，miRNA-23a可以 显著抑制报告基因的表达，提示它们为miRNA．23a的靶基因。 二、小鼠成肌细胞C2C12在体外可诱导终末分化为肌肉细胞。本文应用实时 定量RT。PCR方法分析了C2C12细胞分化过程中miRNA-23a的表达量。结果发 现，miRNA．23a在增殖的细胞中存在低水平表达，在诱导分化的第1天至第3 天持续降低，第5天时miRNA．23a达到一个高水平，而在此过程中C2C12细胞 被诱导肌分化成熟，肌球蛋白重链(Myosinheavy cha氓MHC)的蛋白表达量增 加，提示C2C12细胞中miRNA．23a可能通过调节MHC的表达参与了肌分化。 三、应用miRNA-23a的类似物(mimic)和抑制剂(inhibitor)，证实其对于C2C12 细胞的肌性分化确实具有调节作用。miRNA．23a的血TIllC转染细胞，细胞中MHC 的蛋白表达水平明显降低，而mRNA的转录水平不被抑制，肌性分化受到抑制。 说明miRNA-23a作用于翻译水平，在转录水平没有作用。 四、成肌细胞可正常增殖，在分化条件下从细胞周期退出，进入分化过程。BrdU 是一种核苷类似物，在细胞周期的S期可参入DNA链。本文应用免疫荧光技术 发现，在诱导分化的C2C12细胞中， mimic转染细胞BrdU的参入水平明显高 于对照组，说明miRNA一23a促进了细胞的增殖，与以上的抑制分化结果一致。 五、已有的研究发现，在不同的细胞中，miRNA一23a通过调节不同的靶基因发 挥不同的功能。我们通过生物信息学分析也发现，与肌肉分化相关的一些调节因 子或功能蛋白如MEF．2C及Muff等也存在miRNA-23a的互补结合序列。本文 对miRNA．23a可能的靶基因也进行了分析。结果发现，miRNA．23a mimic抑制 了MEF．2C的表达，对于MufF则没有作用。萤光素酶报告基因结果表明， 摘要miRNA-23a对于MEF．2C的转录没有抑制作用。其可能通过其他途径调节 摘要 miRNA-23a对于MEF．2C的转录没有抑制作用。其可能通过其他途径调节 MEF．2C的表达。 综上所述，本文发现miRNA一23a通过调节MHC的翻译直接调节肌肉分化 过程的肌终末分化，本文的研究结果为肌肉分化的调节提供了一个新的可能的机 制。 关键词：miR．NA，肌肉分化，C2C12细胞，肌球蛋白重链 Ⅱ AbstractAbstract Abstract Abstract Vertebrate skeletal muscle differentiation is regulated by all intricate network of transcription factors．Numerous genes，including growth factors，regulatory proteins， receptors，and transcription factors have been identified to participate in the regulation of myogenesis．Several signal transduction pathways are involved in positive or negative regulation of myogenesis．Recently,microRNAs(miRNAs)are reported to freely regulate the development of skeletal muscle at