miR203靶向SMAD3影响鼠肝星状细胞胶原合成与增殖.docxVIP

温州医科大学硕士学位论文m 温州医科大学硕士学位论文 m i R-203靶向SMAD3影响大鼠肝星状细胞胶原合成与增殖 中文摘要 背景：肝星状细胞(HSCs)活化是肝纤维化发生发展的关键环节，活化后的肝星 状细胞是纤维性胶原蛋白等细胞外基质(EcM)成分的主要来源。抑制HSCs活化 增殖及ECM合成与沉积是目前研究抗纤维化治疗的策略之一。有研究表明 microRNAs(miRNAs)在HSCs活化增殖过程及ECM合成方面起到重要的调节作用。 目的：本研究在细胞水平探索miR-203对大鼠肝星状细胞增殖及胶原合成的影响 的机制研究。 方法： 第一部分：miR-203对大鼠肝星状细胞增殖及胶原合成的影响 1．大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)分为三组：分别转染miR一203 mimics(相似物)， miR-203 inhibitor(抑制物)及无关miRNA(scramble miRNA)，转染介质为 lipofectamine 2000。瞬时转染48h后分别提取总RNA和总蛋白； 2．实时荧光定量PCR(qRT—PCR)检测每组miR一203，I型胶原蛋白(COLl／11)， Ⅲ型胶原蛋白(COL3A1)及Q平滑肌肌动蛋白(a-SMA)信使RNA(mRNA)表达 情况； 3．Western Bolt检测每组COLl．41，COL3A1及口喝励蛋白表达情况。 4．MTT法检测每组HSCs细胞增殖情况。 第二部分：miR-203对大鼠肝星状细胞SMAD3表达的影响及miR一203与SMAD3的 靶向关系检测 1．HSC-T6分为三组：分别转染miR-203 mimics，miR-203 inhibitor及无关mirNA (scramble miRNA)，转染介质为lipofectamine 2000。提取总RNA和总蛋白用 于后续检测； 2．实时荧光定量PCR(qRT—PCR)检测每组miR-203及SMAD3 mRNA的表达情况； 3．western blot检测SMAD3蛋白的表达情况 4．生物信息学预测SHAD3是mir-203的靶基因，双荧光素酶报告基因试验检测 miR-203与SMAD3之间的靶向关系。 结果： 第一部分： 1．miR-203 mimics组与对照组(Scramble组)相比miR一203表达明显增加， 2 万方数据 温州医科大学硕士学位论文miR一203 温州医科大学硕士学位论文 miR一203 inhibitor组miR-203表达则显著下调；miR一203 mimics组COLl．41， COL3．41及CI-S,94的mRNA及蛋白表达较Scramble组明显减少，miR一203 inhibitor组COLI．41，COL3．41及口咽坳mRNA及蛋白表达则明显增加。 2．MTT试验结果提示上调miR-203表达抑制HSCs增殖，下调miR一203表达则促 进HSCs增殖； 第二部分： 1．miR-203 mimics组与对照组(Scramble组)相比miR-203表达明显增加， miR-203 inhibitor组miR-203表达则显著下调；miR一203 mimics组S94D3的 mRNA及蛋白表达较Scramble组明显减少，miR-203 inhibitor组SYAD3的mRNA 及蛋白表达则明显增加。 2．双荧光素酶报告基因试验结果显示删是miR一203的靶基因。 结论：我们的研究表明miR-203可能通过靶向SMAD3抑制大鼠肝星状细胞增殖及 胶原合成。 关键词：miR-203，肝星状细胞，胶原，Q平滑肌动蛋白(0【．SMA)，S94D3 万方数据 温州医科大学硕士学位论文miR-203 温州医科大学硕士学位论文 miR-203 inhibits collagen synthesis and proliferation in hepatic stellate cells(I-ISCs)through a Smad3-dependent mechanism Abstract Background：Activation of hepatic stellate cells(HSCs)is a pivoml event in liver fibrogenesis,and activated HSCs ale the main source of collagen and other extracellulal matrix(ECM)components．Emerging antifibrotic therapies ale aimed at preventing the synthesis and deposition of ECM．Recently,num