抗egfr纳米抗体的制备及其活性研行究论文.docx

研究生优秀毕业论文  大连理工大学硕士学位论文 摘 要 抗表皮生长因子受体(epide珊al gro谢h nlctor receptor，EGFR)的纳米抗体由于具 有相比普通单克隆抗体更优异的溶解性、稳定性、渗透性和易于融合表达并且获得多价 抗体等优点，在肿瘤的临床诊断和治疗方面具有重要的潜在应用价值。然而，大规模获 得有活性的抗EGFR纳米抗体仍然是目前研究中的难点，是其广泛应用的重要制约因 素。本研究通过进行基因序列改造、诱导表达和分离纯化获得了高纯度的5种抗EGFR 纳米抗体的包涵体，随后通过优化包涵体的复性条件显著提高了纳米抗体的产率。又通 过综合评价复性纳米抗体的结合活性和癌症细胞表面受体识别能力证实了获得的纳米 抗体具有高活性。论文的研究内容包括： (1)抗EGFR纳米抗体的诱导表达：通过基因工程技术，在大肠杆菌(Bc乃Prf幽砌 ∞纪E∞，f)BL21(DE3)中进行了5种抗EGFR纳米抗体的原核表达。通过比较诱导剂 IPTG的加入浓度，加入时间及诱导时间，最终确定纳米抗体的最佳表达条件为37℃， IPTG加入时间为菌种开始培养4 h后，加入量为O．4 mM，诱导表达4 h，最终可使抗 EGFR纳米抗体的表达量占总蛋白的25％。通过SDS．PAGE进行目的蛋白的可溶性检测 得知，表达的纳米抗体主要以包涵体形式存在。 (2)抗EGFR纳米抗体的分离纯化及包涵体复性：本研究通过在抗EGFR纳米抗 体C端加入6个His标签，并使用金属离子螯合层析法，梯度增强咪唑浓度(100 mM 咪唑、300 mM咪唑)洗脱，显著提高了抗EGFR纳米抗体的纯度，5种纳米抗体的最 终纯度均在90％以上。通过使用Bradfbrd法和细胞E1isa对透析复性和稀释复性的可溶 性蛋白收率和纳米抗体活性进行了比较评价，最终采用稀释复性的方法，并迸一步对影 响稀释复性的6种参数(初始蛋白浓度、稀释液滴加速率、复性pH、添加剂种类、精 氨酸浓度、还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比例)进行考察，确定最佳的稀释复性条 件为：初始蛋白浓度0．3．0．4 mg／mL，复性pH=8．0，添加200 mM精氨酸及比例为5：1 的还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽，包涵体复性率为73％，纳米抗体最终得率为38％。 (3)抗EGFR纳米抗体活性评价及作用靶点研究：本研究通过使用细胞Elisa的方 法评价了所获得的5种纳米抗体的结合活性，最终确定所获得的5种抗EGFR纳米抗体 均具有抗原结合活性，并且纳米抗体C活性最高。进一步通过间接免疫荧光技术和MTT 法确认了所获得抗EGFR纳米抗体能够识别表皮癌细胞A43 1表面EGFR受体，并且能 够与EGF竞争结合EGFR受体，显著抑制肿瘤细胞的增殖(浓度为5“mol／L时的增殖 抑制率达75％) 万方数据  抗EGFR纳米抗体的制备及其活性研究 综上所述，本研究所提出的制备和纯化方法使得快速，方便并且大规模获得具有高 活性的抗EGFR纳米抗体成为了可能，对未来的基于纳米抗体的生物识别和给药研究打 下了良好的基础，并且对于抗EGFR纳米抗体的作用机理研究和相关的临床诊断及治疗 应用具有重要的实践意义。 关键词：抗EGFR纳米抗体；分离纯化；复性；靶向识别 万方数据  大连理工大学硕士学位论文 The preparation and eValuation of anti-EGFR nanobody Ab stract Anti—EGFR nanobody has potential value in cancer diagnosis and therapeutics for its better solubility， stabili够and easiness to expression as fusion protein compared with monoclonal antibody．Nevenheless’hi曲yield a11d activ耐of aJlti．EGFR naIlobody is still hard to obtain cullrently which limit the progress in anti—EGFR study．In the present study，5 gene sequences modified anti．EGFR nanobodies were successively expressed and purified as inclusion bodies。Furthermore，the yield of soluble nanobodies waS凡rther r西sed mrough optimizing remtllration process．The oVe