决明kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因(coti2)的克隆、表达与分析-生物化才学与分子生物学专业毕业论文.docx

西南交通大学硕士学位论文主要工作(贡献)声明本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下： 西南交通大学硕士学位论文主要工作(贡献)声明 本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下： 1)基于决明转录组数据中编号为BMK．39169的序列，首次克隆了决明Kunitz型 胰蛋白酶抑制剂基NI(CoTl2)的全长cDNA序列，该序列长度为792bp，包含一个长度 为746bp的ORF，编码一条长度为248个氨基酸的肽链。通过生物信息学初步对CoTl2 蛋白的亚细胞定位、亲疏水性、与其他物种的进化关系以及密码子偏好性做了分析。 同时，对CoTl2蛋白的跨膜结构域、二级结构、信号肽以及基本理化性质进行预测， 这为后续研究CoTl2的分子机理与功能奠定理论基础。 2)根据决明CoTl2全长cDNA序列，设计实时荧光定量PCR的特异引物，分析 了CoTl2在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式，为后期研究决明在低温、干旱、 高盐、ABA以及Meja等胁迫下的代谢通路提供依据。 3)首次构建了CoTl2．pET28a原核表达重组质粒，转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中 诱导表达，检测重组蛋白的可溶性，并获得最佳表达条件，这为CoTl2蛋白的分离纯 化及生化功能鉴定奠定基础。 4)构建了ZCoTl2。pBll21真核表达重组质粒，并转化拟南芥，初步得到了含重组 蛋白的拟南芥，这为研究CoTl2在植物中的生理作用以及后代遗传打下基础。 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体己经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中作了明确说明。 本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。 兰竺敝赁，獬：捣妈 日期：∥心．s t／(} 万方数据 西南交通大学硕士研究生学位论文 西南交通大学硕士研究生学位论文 第1页 摘要 决明(Cassia obtusifolia L．)是豆科一年生植物，作为传统药食同源的中草药，其干 燥成熟种子即为决明子，是主要的药用部位。前期研究表明，决明中含有胰蛋白酶抑 制剂，具有抗鳞翅目害虫的活性。本文首先通过对决明转录组数据的分析，从中筛选 出一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的候选基因，随后对该候选基因展开基因克隆、表达、 生物信息学和表达模式分析，为后期该基因的功能鉴定与分子机制的研究提供依据。 主要结果如下： 1)采用RACE技术，首次克隆了决明Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基N(CoTl2)全长， 该序列全长为792bp，包含746bp的ORF，编码248个氨基酸，所表达的蛋白分子量 为26．68 KDa，等电点为5．03，其中含有11．26％的酸性氨基酸，7．1％的碱性氨基酸， 36．94％的中性疏水氨基酸和27．48％的中性亲水氨基酸，具有较强的疏水性。 2)通过生物信息学初步对CoTl2蛋白的基本理化性质与结构进行预测：CoTl2的 N端含有26个氨基酸的信号肽；主要定位于植物的膜外或液泡中，并且N端1．11个 氨基酸残基在膜内，35．247个氨基酸残基在膜外，为跨膜蛋白；通过酶切位点分析， 确定了CoTl2原核表达酶切位点分别为BamHI和EcoRI，真核表达酶切位点为BamHI 和SnaBI；密码子偏好性分析表明决明CoTl2主要偏好使用以U／A结尾的密码子，这 有利于CoTl2选择最优表达系统；CoTl2的二级结构中包含66个氨基酸的0t螺旋，28 个D折叠和154个无规则卷曲，无规则卷曲结构占总氨基酸的一半以上，推测决明CoTl2 的功能结构域很可能就在这个位置；同源性分析出Lysl08为关键残基，还含有Cys84， Cysl35，Cysl87，Cys200四个Cys，可能参与二硫键的形成；通过对CoTl2与其他物 种KTI的进化关系分析得出，CoTl2与拟南芥进化关系更近，是最优真核表达系统。 3)RT．qPCR结果表明决明CoTl2在不同组织中差异表达，在未成熟种子、果荚、 愈伤组织和胚轴中优势表达，其中未成熟种子中表达量最高，花中相对表达量最低； 在胁迫条件下，除盐胁迫基本不影响CoTl2的表达外，干旱、机械损伤、ABA、Meja 和低温总体上均表现为表达上调，说明胁迫条件可以刺激CoTl2基因的表达，来抑制 体内胰蛋白酶的降解。为研究决明CoTl2在不同组织中的功能以及在胁迫下的代谢通 路提供依据。 4)首次构建了CoTl2一pET28a原核表达重组质粒，转入大肠杆菌Rosetta(DE3)qh 万方数据 西南交通大学硕士研究生学位论文 西南交通大学硕士研究生学位论文 第1I页 诱导表达，并优化出最佳表达条件：1．6 mM的IPTG在27℃诱导表达7 h，这为重