卡介苗基因缺失株bcgδwag22的构建及balbc就小鼠潜伏感染模型的建立.docx

卡介茁基因缺失株BCGAWa922的构建及BALB／cdx潜伏感染模型的建立目 卡介茁基因缺失株BCGAWa922的构建及BALB／cdx潜伏感染模型的建立 目 录 摘 要 ．．i Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．iii 缩略语表(Abbreviations) v l前言 ．1 1．1结核病的发现 一1 1．2结核病的国内外现状 ．．1 1．3结核病的病原学 一2 1．4结核分枝杆菌与宿主的作用机制 一2 1．5结核病疫苗的研制 一3 1．5．1减毒活疫苗一卡介苗 3 1．5．2重组BCG疫苗和减毒活性结核疫苗 4 1．5．3亚单位疫苗和活载体疫苗 4 1．5．4 DNA疫苗 5 1．5．5灭活疫苗 5 1．6 PE／PPE蛋白家族 一5 1．6．1 pe／ppe家族的进化和变异 ．6 1．6．2 PE／PPE家族的调控 6 1．6．3 PE／PPE家族蛋白与宿主免疫应答反应的关系 ．9 2研究目的与意义 10 3实验材料 11 3．1培养基及主要抗生素的配制 1 1 3．2各种分子生物学酶、常用试剂盒及常用试剂 11 3．3溶液及缓冲液 12 3．4质粒 13 3．5菌株 一13 3．6引物序列表 14 4实验方法 15 4．1卡介苗BCG缺失突变株的构建 15 4．1．1卡介苗BCG同源载体的构建 ．15 4．1．2分枝杆菌噬菌体的制备 ．20 4．1．3分枝杆菌噬菌体感染BCG获得基因缺失株 ．21 4．1．4缺失突变株的鉴定 ．21 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文4．2缺失突变株BCGAWa922菌落形态的变化 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 4．2缺失突变株BCGAWa922菌落形态的变化 22 4．3缺失突变株BCGAWa922生长曲线的测定 23 4．3．1原始菌液的处理 ．．23 4．3．2生长曲线的测定 一23 4．4吞噬存活实验 ．23 4．4．1细胞与细菌培养 ．．23 4．5 BCGAWa922对RAW264．7细胞毒性实验 ．．24 4．5．1细胞与细菌培养 ．．24 4．5．2不同菌株与RAW264．7细胞互作 24 4．5．3 LDH Cytotoxicity Assay Kit工作液的准备 ．24 4．5．4样品的测定 ．．24 4．6 PE—PGRS家族蛋Wa922对小鼠巨噬细胞RAW264．7的作用 25 4．6．1原核表达载体的构建 ．．25 4．6．2蛋白质的小量表达及表达条件的优化 ．．27 4．6．3蛋白质的大量表达及包涵体蛋白的提取 ．．27 4．7动物实验一潜伏感染模型的建立 ．28 5结果与分析 29 5．1缺失突变体的构建 ．29 5．1．1 BCG缺失突变株的构建 ．．29 5．2缺失突变株BCGAWa922菌落形态的变化 32 5．3生长曲线的测定 ．33 5．4吞噬存活实验 ．34 5．5 BCGAWa922对RAW264．7细胞毒性实验 ．．34 5．6原核表达结核分枝杆菌PE．PGRS家族蛋I刍Wa922 ．35 5．6．1目的蛋白Wa922理化性质和二级结构的分析 ．．35 5．6．2原核表达载体的构建 ．．37 5．6．3蛋Wa922的诱导表达及表达条件的优化 ．．38 5．6．4包涵体蛋白的提取、纯化及Western blot验证 ．39 5．7动物实验一潜伏感染模型的建立 ．40 5．7．1体重的监测 ．．40 5．7．2相关病理变化 ．．41 5．7．3细胞因子的变化 ．．44 6讨{仑 45 万方数据 卡介茁基因缺失株BCGAWa922的构建NtBALB／cd、鼠潜伏感染模型的建立6．1新型结核缺失突变株的构建方法分析 卡介茁基因缺失株BCGAWa922的构建NtBALB／cd、鼠潜伏感染模型的建立 6．1新型结核缺失突变株的构建方法分析 45 6．2 PE—PGRS家族蛋I刍Wa922 一45 6．3细胞因子与免疫反应 46 7结论 ．．47 参考文献 48 致谢 ．56 万方数据 卡介茁基因缺失株BCGAWa922的构建及BAJ。Bled潜伏感染模型的建立摘要 卡介茁基因缺失株BCGAWa922的构建及BAJ。Bled潜伏感染模型的建立 摘要 结核分枝杆菌是造成结核病的主要病原，结核病作为一种世界性的疾病，在全 世界范围内造成了巨大的精神和物质伤害。在完成结核分枝杆菌群基因组测序后， 发现了一个在全基因组中占有10％的比重的一个家族 PE和PPE家族，而PE家族根 据其C端的序列的不同特点分为弘和