HMME导的光动力疗法制备鼠肝癌细胞MM45TLi疫苗的研究.docxVIP

天津医科大学博士学位论文中文摘要 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是一种治疗恶性肿瘤和某些良性 增生性疾病的新方法。光动力疗法在对肿瘤细胞产生直接的杀伤作用同时，还 可以增强宿主的抗肿瘤免疫反应。目前已有研究建立了光动力疗法制备肿瘤疫 苗的方法，但对于光动力疗法制备肝癌疫苗的研究并不多见。本研究以鼠肝癌 细胞MM45T-Li为研究模型，探讨利用光动力疗法制备肝癌疫苗的抗瘤效应， 为肝癌的免疫治疗提供一种新的途径。 目的 1．探讨光动力疗法在体外对鼠肝癌细胞MM45T-Li的杀伤作用特点，以寻找 光动力疗法制备疫苗的作用参数。 2．分析光动力疗法制备的肿瘤疫苗对小鼠肝癌移植瘤的体内预防保护和治 疗作用，比较不同光照剂量对PDT制备细胞疫苗的影响。 3．探讨光动力疗法制备肿瘤细胞疫苗对小鼠体内抗肿瘤免疫反应的影响。 方法 1．利用荧光显微镜观察不同浓度HMME在MM45T-Li细胞中的吸收；多功 能酶标仪定量分析细胞内HMME在不同时间点的荧光强度；共聚焦显微镜观察 HMME在MM45T-Li细胞中的亚细胞定位；在以HMME为光敏剂，630nm激 光为光源的PDT作用于细胞，MTT法检测光动力疗法对细胞的杀伤效应。 Hoechst细胞核荧光染色法观察光动力疗法对细胞核形态的改变。 AnnexinV-FITc／PI双染结合流式细胞仪检测光动力疗法检测光动力疗法诱导的 细胞凋亡。 2．在功率密度为15mw／cm2的条件下，利用不同能量密度的光动力疗法作 用细胞24h后提取细胞裂解液作为肿瘤疫苗。以生理盐水作为对照，反复冻融 法制备的疫苗为阳性对照。疫苗免疫小鼠后建立小鼠肝癌模型，观察肿瘤体积 变化。肿瘤生长至第16天，处死小鼠，称量肿瘤重量，HE染色观察肿瘤病理 组织学变化。 3．免疫接种结束后7d，流式细胞术检测外周血T细胞亚群的变化。同时利 用阶梯密度离心法提取脾淋巴细胞，MTT法检测体外淋巴细胞毒性。 天津医科大学博士学位论文4．检测疫苗的治疗作用：建立小鼠肝癌模型，疫苗免疫荷瘤小鼠，观察肿 天津医科大学博士学位论文 4．检测疫苗的治疗作用：建立小鼠肝癌模型，疫苗免疫荷瘤小鼠，观察肿 瘤体积变化。观察周期为60天，计录荷瘤小鼠生存期。 结果 1．细胞内HMME含量随着光敏剂浓度及孵育时间的增加而增加。选择4h 孵育时间及浓度为2099／ml的HMME作为PDT的最佳参数。共聚焦荧光显微 镜显示HMME分布在细胞核外，定位于线粒体。MTT检测结果显示PDT对细 胞的杀伤率随着光敏剂浓度和能量密度的增加而增加。当HMME浓度为 20}．tg／ml，光照剂量为2．7 J／cm2时，PDT对细胞的杀伤率30．21％；光照剂量为 7．2J／cm2时，杀伤率达90．65％。Hoechst染色观察PDT作用24h后部分细胞出现 染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变。AnnexinV／PI流式细胞术检测结果 显示在能量密度为0．9至4．5J／cm2时，PDT诱导的细胞凋亡随着能量密度的增加 而增加，最到达30．5±4．2％；当能量密度增加至7．2J／cm2时，细胞以坏死为主， 凋亡率下降为4．1±2．7％。 2．依据PDT的杀伤效果，选择能量密度为2．7和7．2J／cm2的光照剂量制备疫 苗。在疫苗对荷瘤小鼠的预防保护实验中，与对照组相比，2．7J／cm2PDT组疫苗 的肿瘤生长缓慢，肿瘤的体积及重量明显降低。对肿瘤体积的抑制率最高为 59．8％。而大剂量7．2J／cm2PDT组中的肿瘤体积重量下降不明显。各组肿瘤的病 理组织表现无明显差异。 3．与对照组比较，2．7J／cm2 PDT及7．2J／cm2 PDT组疫苗可以明显改善机体 免疫系统功能状态，逆转外周血T细胞亚群CD4+／CD8+的比值，增加NK细胞 比例，同时增加脾淋巴细胞特异性细胞毒性。 4．在疫苗对荷瘤小鼠的治疗实验中，2．7J／cm2 PDT组疫苗的肿瘤生长缓慢， 甚至消退，明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并提高荷瘤小鼠生存率。 结论 1．HMME介导的光动力疗法可以有效杀伤鼠肝癌细胞MM45T-Li，诱导的 细胞凋亡与光照剂量密切相关。 2．光动力疗法制备的肝癌细胞疫苗明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，具有预 防保护和治疗作用。小剂量2．7J／cm2PDT制备疫苗的抗瘤效果优于大剂量 7．2J／cm2PDT制备的疫苗。 3．光动力疗法制各的肝癌细胞疫苗可以有效增强抗肿瘤免疫反应。 天津医科大学博士学位论文关键词：光动力疗法疫苗肝癌光敏剂血卟啉单甲醚凋亡 天津医科大学博士学位论文 关键词：光动力疗法疫苗肝癌光敏剂血卟啉单甲醚凋亡 III 天津医科大学博士学位论文Abstract 天津医科大学博士学位论文 Abstract