亲和层析法纯化胰点蛋白酶.ppt

2亲和介质合成 2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化 2.1.1 琼脂糖凝胶层析介质的处理 称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内，用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。 2.1.2配方 琼脂糖凝胶层析介质--QT410克 蒸馏水7ml 1,4二氧六环8 ml 2 mol/L NaOH 6.5ml 环氧氯丙烷1.5ml。 2.1.3活化 将配制的好介质的三角瓶，放入45℃恒温水浴中，于160转/分钟，振摇活化2小时。停止活化，转移到G-3玻璃烧结漏斗内，抽去活化剂，用100ml蒸馏水洗（少量多次），转移100ml到三角瓶中，准备偶联。 2.2偶联 称取约100mg鸡卵粘蛋白，用10ml 0.1mol/L pH9.5 Na2CO3缓冲液充分溶解。取0.1ml稀释10倍测定OD280，计算溶液的蛋白浓度。然后将溶解好的鸡卵粘蛋白溶液，转移到100ml三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀。在40℃恒温水浴中，于160转/分钟，振摇偶联22小时左右，停止偶联。 2.3洗涤 取一个洗净的500ml抽滤瓶，将已经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质转移到G-3玻璃烧结漏斗内抽滤，收集滤液，测定滤液中剩余的鸡卵粘蛋白的含量。 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml 蒸馏水抽洗，再用20ml 亲和层析洗脱液洗涤。 将亲和介质转移到50ml的小烧杯内，加入20ml 亲和层析平衡液，浸泡20分钟，脱气，装柱。 3胰蛋白酶粗提液的制备 3.1胰蛋白酶的基本性质 3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于动物的胰脏或其他组织中。在底物的诱导下或激活剂的作用下，酶原的C端水解，去6肽转变成具有活性的胰蛋白酶。 - 6 肽 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 Ca+2 激活剂 3.1.2等电点与分子量： 胰蛋白酶原的 pI=10.8 ， 分子量：24000Da 胰蛋白酶的 pI=8.9 ， 分子量：23700Da 3.1.3 稳定性 胰蛋白酶在酸性环境中很稳定，在碱性环境中容易自溶，在提取的过程中要注意溶液的pH值。 ? 当溶液的 pH ? 2.0 容易变性 pH = 3.0 生物活性稳定 pH ? 7.0 容易自溶 3.2胰蛋白酶原的提取 (1)匀桨: 取约30克猪胰脏，剥去结缔组织和脂肪，取净重20-25克左右,剪成碎块。转移到组织捣碎器内,加入150ml 预冷的3.5%的乙酸酸化水,匀桨. (2)提取: 转移到500ml烧杯中,用2mol/L硫酸调节pH值在3.5-4.0之间,10℃搅拌提取约4小时. (3)过滤: 取一块纱布,折叠成四层,用水润湿,放在玻璃漏斗上,将胰蛋白酶原提取液过滤,收集滤液. (4)酸化: 用2mol/L硫酸调节滤液的pH值至2.5-3.0之间,4℃冰箱静止沉淀4小时以上。 (5)过滤: 折叠滤纸过滤,收滤液。 3.3胰蛋白酶原的激活 (1)调节pH值: 用5mol/L NaOH 将滤液精确调节pH值至pH8.0,量取溶液体积. (2)加激活剂: 加入固体CaCl2使溶液的Ca+2 终浓度达到0.1mol/L,然后加入约5mg 结晶胰蛋白酶,混匀,激活. (3)激活时间: 在4℃冰箱内激活12-16小时, 在25℃恒温水浴中激活2-4小时. * 亲和层析法纯化胰蛋白酶 ? 第一部分 实验内容简介 1 内容摘要 亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性。在亲和结合的过程中涉及到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等因素的影响。 亲和层析的概念可以理解为配基以共价键的形式与水不溶性固体载体共价结合， 形成具有高度专一性的亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂的混合物中有针对性分离某一种成分。 本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过