四氯化碳引起小鼠血清alt号升高的分子机制及人alt同工酶分子克隆、蛋白表达、纯化及相关研究-劳动卫生与环境卫生学专业毕业论文.docxVIP

·英文缩略语·14 ·英文缩略语· 14 中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 亟l茎1 日期：通：墨!兰 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密 内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 ·中文论著摘要·四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子机制及人ALT ·中文论著摘要· 四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子机制及人ALT 同工酶分子克隆、蛋白表达、纯化及相关研究 刖 吾 丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)，曾被称为谷丙转氨酶， 在L．丙氨酸和0【．酮戊二酸之间催化可逆性的转氨反应形成丙酮酸和L．谷氨酸。 √岍通过产生以上这四种重要的代谢中间产物，在糖异生和氨基酸代谢中起重要 作用，尤其在禁食和运动时丙氨酸在创LT作用下通过脱氨基作用形成丙酮酸，进 而生成葡萄糖。 ALT被广泛用作肝脏损害的标志物。一些职业性有害因素以肝脏为主要毒作 用靶器官而引起职业性中毒性肝病，如铅、铊等金属及四氯化碳(carbon tetrachloride，CCh)或有机磷等中毒时可引起血清ALT活性显著升高。然而，血 清ALT活性升高也会在非肝损害时出现，例如多发性肌炎、肥胖、代谢性疾病以 及健康受试者中。反之，血清ALT在部分已确诊为肝损害的病人中并不升高，如 肝硬化代偿期、NASH及C型肝炎病毒感染。ALT作为肝损害的主要标志物的原 因是在于它的特异性及在肝组织中的大量表达，该酶在肝损害时从肝细胞中泄漏 后入血引起血清ALT升高。在先前的研究中大都测定ALT的活性，但关于该活 性或活性改变的分子机制却罕见报导。到目前为止我们仍然不知道—岍在肝损害 时升高的确切机制。 近来，两种ALT同工酶，ALTl和ALT2在人类和小鼠中均被确定，他们由 不同的基因编码并且在mRNA水平上的组织表达也不同；ALTl主要在小肠、肝 脏、肾脏和心脏中表达，而ALT2则主要在肌肉、脑、脂肪和肾脏中表达，提示 两种同工酶在生物学上可能存在功能差别。我们推测两种ALT同工酶都在血清中 存在，并且共同构成舢玎活性，因此分别测定ALT同工酶可能对探讨血清-岍 升高的分子机制提供有价值的理论依据。在本研究中，我们首先检测SD大鼠ALT 同工酶在多种组织中的蛋白分布，然后采用一种经典的职业肝损害毒物CCh急性 腹腔注射C57816小鼠，观察处理前后血清ALT同工酶蛋白变化；其次，克隆hALTl 腹腔注射C57816小鼠，观察处理前后血清ALT同工酶蛋白变化；其次，克隆hALTl 和hALT2 eDNA，并转入昆虫细胞中表达重组hALTl和hALT2蛋白，然后进行纯 化，并对其进行初步的特性识别；通过前一部分产生的重组hALTl和hALT2蛋 白制备并纯化特异性的hALTl和hALT2多克隆抗体，并利用这两种特异性抗体 去检测人血清中ALT同工酶的蛋白表达，探讨肝损害时血清ALT升高的分子机 制，为将来对于血清创』改变在职业性肝损害、非职业因素引起的肝损害或者正 常与疾病状态的研究提供必要的基础资料。血清ALT同工酶蛋白的测定，可能对 于诊断职业性肝损害或非肝损害的性质和程度提供了一个新的前景。 材料与方法 1、实验动物样品制备 lO只Sprague—Dowley(SD)大鼠，取肝脏、肌肉、脑组织、小肠、肾、心脏、 结肠、棕色脂肪和附睾白色脂肪组织，约0．2mg组织加入lml NP40裂解液匀浆后， 3,000xg，4。C离心10min，取上清，测定组织蛋白浓度，调整样品蛋白浓度为 20ttg／39l。4只8周龄雄性C57816小鼠，按2ml／kg体重腹腔注射CCl4，24h后取 血清。 2、血清和肝组织剐_一T活性测定 利用ALT活性与单位时间内NADH