模块四逆高境胁迫对植物生理生化指标的.pptVIP

逆境胁迫对植物生理生化指标的影响 李忠光，2011.5.25 目 的 掌握逆境胁迫下一些植物生理指标的测定方法； 了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和适应的原因。 流 程 图 实 验 原 理 I 实 验 原 理 I 实 验 原 理 I 实 验 原 理 II 实 验 原 理 III 实 验 原 理 IV 实 验 原 理 V 实 验 原 理 VI 实 验 原 理 VII 实 验 原 理 VIII 实 验 方 法 I 种子发芽率的测定：各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验： 其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴 20 min） 另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min） 根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。 实 验 方 法 I 品种为晴3或鲁玉13的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司）→ 用0.1% HgCl2消毒10 min后 → 用蒸馏水漂洗干净 → 用蒸馏水于26℃下吸涨12 h → 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中 → 于26℃下暗萌发60 h →计算发芽率（注意与前面结果比较） → 选取长势一致的玉米幼苗做干旱5天、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。 实 验 方 法 II 呼吸作用的测定： 材料的准备：将预测量的材料称重后（0.5g）放入测量瓶。 测定方法：打开电源预热5 min→打开气泵开关→打开闭路开关→用碱石灰管分别连接面板上的“OUT”和“IN”， 主机的“OUT1”和“IN1”分别与测量瓶的“OUT1”和“IN1”相连→立即开始记时→测量1min的CO2增加量 计算：每分钟每克材料的CO2释放量（mL.g-1.min-1）。 实 验 方 法 III Pro的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：上清液各2 mL →分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂→煮沸15 min→冷却后→5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤） →分别测定A520 计算： 实 验 方 法 IV MDA提取：分别取0.1 g实验组和对照组→加入3 mL 10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 10%TCA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA（用10%TCA配制） 2 mL→煮沸12 min→冷却后→5000 rpm离心5 min （视沉淀有无）→分别测定OD450和OD532 计算： 实 验 方 法 V H2O2提取：分别取0.1 g实验组和对照组→加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：分别取上清液各3 mL →加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] 1 mL→摇匀→ 5000 rpm离心10 min → OD410 计算： 实 验 方 法 VI 1、抗氧化酶的提取：分别取0.1 g实验材料→加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP） → 充分研磨　→转入离心管中→用2 ml提取液洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 ml →用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。 　 实 验 方 法 VI 2、POD测定：取POD反应混合液（10　mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2 min时的A470。 3、PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9 ml，加入酶液0.1 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410。 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则： 实 验 方 法 VI 实 验 方 法 VII GSH的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5%