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PCR引物设计及相关软件使用 主要内容 PCR介绍 引物设计原理 引物设计的优化原则 Primer Premier 5.0 介绍 举例说明引物的设计 PCR介绍 1、什么是PCR 2、PCR的组成 3、如何提高PCR成功率 （定量，对照） 引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。 引物设计的原则 1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物。 引物设计的原则 2、引物GC含量 GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。 引物设计的原则 3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G) 引物设计的原则 4、引物3’端 引物3’末端和模板的碱基完全配对 防止一对引物内的同源性 考虑末端5个碱基的ΔG 引物3′端要避开密码子的第3位 引物设计的原则 5、引物序列与模板序列组成的相似性 可能的错误引发位点决定于引