《蛋白质双向电泳及质谱技术》-课件设计（公开）.pptVIP

蛋白质双向电泳及质谱技术 大连理工大学 refine 蛋白质双向电泳技术 双向电泳简介 2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。 第一向—等点聚焦(IEF) pH梯度载体 pI 第二向—十二烷基硫酸钠(SDS) SDS作为变性剂和助溶剂 分子量 双向电泳具体步骤 样品制备 缓冲液的配制 IPG条重泡涨及上样 第一向：IEF IPG条平衡 平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化) 第二向：SDS胶条染色 成像及图像分析 为什么要进行样品制备 目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。 待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。 样品制备原则 1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。 2 最大限度减少样品的损失 低温保存样品(一般需低于-86℃) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。 样品制备流程及注意事项 样品的破碎 原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解 样品的来源 易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌 温和破碎法 渗透压冲击(培养的细胞) 低渗液中的悬浮细胞 反复冻融法(细菌) 液氮冷冻 去污剂降解(酵母、霉菌) 降解缓冲液(含尿素和去污剂) SDS(应在IEF前去除) 酶降解(植物、细菌、真菌) 溶菌酶(细菌) 纤维素酶，果胶酶(植物) 溶壁酶(酵母) 剧烈破碎法 超声破碎(细胞悬浮液) 需以冰冷却避免过热 弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物 细胞在剪切力作用下破碎 研磨(固体组织，微生物) 液氮中将固体组织磨成细粉末 样品研磨器(用于少量样品的处理) 用于精确样品 珠磨法(胞悬液，微生物) 通过磨珠研磨破坏细胞壁 样品的沉淀 作用 去除杂质 浓缩样品 抑制蛋白酶活性 关键-可溶性 获得可以重新溶解的蛋白 常用方法 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提 对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白 硫脲 SDS 新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱) 样品中杂质的去除 去除原则 尽量不丢失蛋白 减少蛋白的修饰 杂质的主要种类 DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂 其他固体杂质 DNA/RNA的去除 样品中含核酸的不利影响 能被银染色法染色 在凝胶酸性部分产生水平条纹 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀 去除方法 蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 超声(机械破坏)、超高速离心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿) 其他杂质的去除 脂质 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI 丙酮沉淀 多糖 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH 盐 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮 离子去污剂 如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25% 固体杂质 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤 样品的溶解 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一 溶解的目标 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降） 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态 增加样品溶解性的手段 变性剂 改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展 尿素、硫尿 表面活性剂 溶解疏水基团 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等 还原剂 使变性蛋白进一步伸展溶解 含自由巯基的DTT或?-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB) 起载体作用的两性电解质 到达平衡位置形成pH梯度，“运载”电流、pH 捕获样品中少量盐分 浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低) 样品液的准备 标准液： 样品制备注意事项 蛋白质水解 低温 Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质 蛋白抑制剂 特