核酸的分离纯化.ppt

（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM EDTA 作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 0.2M NaOH 1%SDS（新鲜配制） 作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 溶液III 5M KAC：乙酸钾：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85混合 　 作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀， K＋可中和DNA 返回 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：苯酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 返回 （DNA） 返回 碱裂解法步骤 1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 返回 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。 返回 3.2 RNA纯化实例（Trizol法提取总RNA） 　Trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶的活性。Trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 返回 Trizol法提取总RNA步骤 Chloroform 首选Invitrogen 返回 1、每50-100mg 组织加入1ml Trizol ，用匀浆器匀浆处理 ，室温放 置5min，使其充分裂解。12,000rpm 离心5min，弃沉淀。 2、加入氯仿200微升每管，剧烈振荡15s ，室温放置2-3 min 。 12000g ,4℃ ，离心15 min 3、吸取上层水相(约400微升），至另一离心管中。注：千万不要吸 取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于 4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。 4、每使用1ml Trizol 加入0.5 ml 异丙醇，室温10min 。12000g ， 4℃ ，10 min ,弃上清， RNA沉于管底。 5、加入1 mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。12000g， 4℃ ,5min 。尽量弃上清。 6、室温晾干或真空干燥5-10min。加入20微升无Rnase 水溶解RNA 沉淀。 返回 谢 谢 指 导 返回 * 核酸的分离纯化 主要内容 前言 1 核酸分离、纯化原则 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解 2 分离提取核酸的主要步骤 2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存 核酸分离纯化实例 3.1 DNA纯化实例 3.2 RNA纯化实例 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需