细胞融合与单克隆但抗体-1.pptVIP

第三章 细胞融合与单克隆抗体 3.1 细胞融合(cell fusion) 定义:在离体条件下用人工的方法把 不同种的细胞通过无性方式融 合成一个杂合细胞的技术。 3.1.1细胞融合的发展历史 “自发”细胞融合现象： 重要事件 1962年,(日)冈田善雄 仙台病毒促细胞融合 植物细胞融合： 1972年（美）P.S.Carlson——杂种烟草 3.1.2 植物原生质体培养与细胞融合  (Protoplast and Cell fusion) 植物原生质体培养 植物细胞融合 3.1.4 细胞融合的诱导 诱导融合的方法: 不同细胞融合的条件及其主要应用 仙台病毒诱导 仙台病毒(Sendal virus) 融合的可能机制： 病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。 融合过程： 1. 病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞 粘着成堆，在4℃冰浴中细胞紧密靠近，但不 发生融合。 2. 37 ℃温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成 通道，细胞质流通、融汇。 3. 病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、 变圆，完成融合，全过程约15～30分钟。 4. 细胞核也相互合并,完成细胞融合 PEG诱导 融合的可能机制 初步分析 可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 PEG诱导过程注意事项： 控制与分子量、浓度和处理时间 PEG诱导注意事项： pH值以pH7.4~8.0为宜，或略偏碱性 pH8.0~8.2。 PEG融合法优点 效率高 材料方便，操作简易 效果稳定 物理电融合诱导 电融合诱导法原理示意图 电融合优点： 融合率 融合细胞的细胞核总数 植物细胞融合基本过程 去除细胞壁以获得大量的原生质体 诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 – 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合 筛选,培养,促进细胞分裂,分化, 从细胞团,愈伤组织到最后成株 动物细胞融合基本过程 动物单个细胞的获得 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 影响细胞融合的因素 (4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大．缺氧时经常 不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。 融合细胞的特征及其意义 染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失 理论研究——基因定位和绘制基因图工作中 十分有用 应用价值——单克隆抗体 植物育种 融合细胞类型 同核体（homokaryon） 同核体(homokaryon) 异核体(heterokaryon) 非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。 多核体(polykaryon) 含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。 异胞质体(heterocybrid) 不同胞质来源。用射线或细胞松弛素B处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。 杂种细胞筛选方法 （1）遗传互补筛选法 （2）抗性互补筛选法 （3）生长特性筛选法 （4）物理特性筛选法 组织的获得 组织的消化 诱导细胞融合形成杂种细胞 筛选，培养 制备单克隆抗体 获得杂种植株 用途 物理、化学方法（同左） 灭活的病毒 物理（显微操作、电融合） 化学（聚乙二醇） 诱导方法 使细胞分散后诱导细胞融合 去处细胞壁后诱导原生质体融合 细胞融合的方法 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性、植物细胞全能性 细胞融合的原理 动物细胞融合 植物体细胞杂交 比较项目 (1) 亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则 者较易融合；表