融合蛋白上表达系统.ppt

第二章 基因工程的工具酶与载体 第三节 表达载体 二、融合蛋白表达系统 表达载体的基本结构 1、融合蛋白表达系统的概念 蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。 2、用于融合蛋白构建的高表达的担体蛋白 GFP融合蛋白的表达 4、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收 4、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收 5、融合蛋白表达的优点 融合蛋白表达载体移码问题 融合蛋白在体表达--IRES序列的引入 * * 表达蛋白的识别？ 表达蛋白的分离？ 表达蛋白的活性？ 蛋白表达的高效性？ 蛋白表达的可控性？ 目的基因 启动子 担体基因 接头 Met Stop 载体 β-半乳糖苷酶（LacZ） 容易识别、免疫亲和分离 绿色荧光蛋白（GFP） 容易识别 谷胱甘肽转移酶（GST） 免疫亲和分离、维持良好构象 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和分离 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 MCS pUC18/19载体 Lac Z α 目的蛋白 3、融合蛋白表达载体 T7载体系统 His标签 +目的蛋白 谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合蛋白表达系统 ATG GST 目的蛋白 加强GFP表达的哺乳动物细胞融合蛋白表达质粒 目的蛋白 EGFP DNA T4连接酶 Sac I 6100bp Pst I 6100bp Sac I + Pst I 4700+1400bp COS7细胞系 目的基因ZNF325 MCS 目的基因ZNF325 EGFP N 蛋白内切酶 切割位点 梭菌蛋白酶 Arg-C 葡萄球菌蛋白酶 Glu-C 假单孢菌蛋白酶 Lys-C 猪胰蛋白酶 Arg-C Lys-C Arg C N C 担体蛋白 目的蛋白 化学断裂法： 溴化氰（CNBr）甲硫氨酸残基 酶促裂解法 单残基位点与多残基位点断裂法 启动子 担体基因 接头 目的基因 Met Stop Ile-Glu-gly-Arg 凝血因子Xa的识别、作用序列 Ile-Glu-gly-Arg 表达 亲和层析 酶解回收 酶促裂解法：多残基位点 ① 表达率高，稳定性好； ② 通过亲和层析容易对担体蛋白进行分离和纯化； ③ 可以帮助目的蛋白形成正确的空间结构。 ④ 容易将担体蛋白从目的蛋白中裂解出来。 6、构建融合蛋白表达载体的注意事项 目的蛋白的方向 终止密码子问题 目的基因移码问题 ATG EcoR I P1引物 P2引物 BamH I TGA ACG 终止密码子问题 ATG CCA GAC GGG CCC AAT ACC…TAA 目的基因 酶切末端加ATG之间的碱基序列必须是3的倍数！！ 转基因斑马鱼 的载体 转基因果蝇的载体 * *