基因表现连续分析法SAGE及其在植物研究之应用农业试验所王强生.PDFVIP

基因表現連續分析法 （SAGE）及其在植物研究之應用 農業試驗所 王強生 廖仁盟 近來由於人類 、阿拉伯芥及水稻等各物種基因組計畫之快速發展 ，基因序 列之資訊正以史無前例的速度迅速累積中 。然而人類對於基因功能之瞭解程度 卻遠遠落後 。科學家長久以來便對差異性的基因頗感興趣 ，一直希望能依據差 異選殖基因(cloning by difference) ，但是礙於技術層面，往往未能如願。這些年 隨著分子生物學的進展及技術層面的提昇 ，選殖具有差異性的基因已經不再是 夢想 。 傳統上應用於分析基因表現的技術有 ：北方轉漬、RNA 點轉漬及 RT-PCR 方法 ，但每次僅能針對有限基因進行評估分析。其他如：扣除雜交法(subtractive hybridization) 、比較EST 分析法(comparative EST analysis)是用來偵測基因表現 組群(profiles)的變化 。而基因差異篩選法(differential screening)及基因差異展示 法(differential display, DD)則應用於鑑定二個具有差異表現的樣品基因並予分 離 。然而，這些方法並無法大規模有效、準確的偵測基因差異表現，每次僅能 分析有限數目之轉錄訊息 ，更無法提供基因表現量的資料。此外，這些方法一 般也僅能偵測大量表現的 mRNA 。 最近 ，由Velculescu 等人(1995)所發展的 「基因表現連續分析法」 (serial analysis of gene expression, SAGE)可以準確的在同一時間內針對數千個基因進行 基因表現量的分析 ，因此SAGE 已成為一研究後基因組階段(post-genomic era) 基因表現的有力工具 。玆將SAGE 法之原理簡介如下 ： 此法乃利用 Nla III 限制酵素 ，將最靠近cDNA 3’端切位的一個 9- 11 個鹼 基對的短片段 DNA (即標記) ，利用連續的Linker-Ligations 及限制酵素切割的 方法擷取 ，進而利用PCR 擴增標記並予選殖 、定序 ，而每一標記在序列出現頻 度可直接反應每一 mRNA 在組織中表現量的多寡(abundance) 。如果標記可自轉 9 錄訊息中細微位置萃取而得 ，則9 個鹼基對所包含的訊息(4 )已遠較植物中所有 基因數為多 。據估計，阿拉伯芥中約有15,000 – 33,000 個基因 ，因此可以確定 每一個植物基因均可有一獨特的 SAGE 標記來區分 。 1 SAGE 分析法之操作步驟(見圖一) ： 一 、Total RNA 萃取及 mRNA 純化 1. 利用 phenol/chloroform 法 (或其他方法)進行 total RNA 的萃取 ，欲進行SAGE 所需 的 total RNA 最少需 1 mg (假 設 mRNA 的含量為 5 %)以 上 。