等电聚焦电泳-IEFE的基本原理.ppt

等 电 聚 焦 电 泳 一、IEFE 定义 IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。 二、IEFE的特点 （一）优点 1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。 2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。 （二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。 分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。 三、IEFE的基本原理 蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pH＜pI pH＝pI pH＞ pI 在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。 蛋白质分子的电聚焦过程 + pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c 蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端 蛋白质样品中各组分聚焦成区带 在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 进行IEFE必须具备3个条件： ①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 ②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 ③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带 （一）pH梯度的建立 用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度 1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征： ①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。 2.载体两性电解质的合成 本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。 pH范围：pH3~10 3.pH梯度的形成 载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。 pH梯度形成的过程 ㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。 ㈡引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI