定量PCR的试验要素和试验设计.PDF

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定量PCR的试验要素和试验设计

定量PCR的实验要素 和实验设计 定量PCR 实验要素 2 定量PCR实验要素  检测对象 样品  标准曲线 标准品  监控系统故障 阳性对照  监控污染 阴性对照  校准生物学误差 阳性内对照 (IPC)  校准物理误差 参比荧光 (ROX)  降低其余误差 重复实验 3 对样品的要求  DNA纯度:OD260/OD280=1.8,1.6-2.0之间  DNA用量:0.05 ng-100 ng  RNA纯度:OD260/OD280=2.0  cDNA用量:1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1uL  样品中PCR抑制物尽可能少  核酸的完整度  样品的物理特性及合适的处理方法 4 标准品  目的:生成标准曲线,建立CT值与浓度之间的函数关系  要求: 选取具备代表性的标准品 CT = k lgX0 + b 组织样?灭活病毒颗粒?基因组DNA?质粒? 体外转录RNA?纯化的PCR产物? 绝对量已知(拷贝数、质量、浓度) 大于等于5个梯度稀释的标准品 标准品与待测样品的PCR效率一致,且接近100% 与样品的性质尽可能接近; 与样品相同的扩增条件(PCR体系、耗材、同一次扩增) 5 标准品的准备  选择目标→提取/PCR →纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释  所得CT值在18-30之间,覆盖全部样品浓度区间  10倍连续梯度稀释方法: 1. 原液(标准品i) +9v稀释缓冲液,得标准品ii 2. 标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii 3. 标准品iii +9v稀释缓冲液,得标准品iv 4. 标准品iv +9v稀释缓冲液,得标准品v 切不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接稀释为标准品 ii、iii、iv、v ! 6 标准品的单位  标准品的单位决定样品定量结果的单位  根据最终目的选择标准品单位  如果要求测定样品的基因拷贝数,则梯度稀释已知摩尔浓度的 DNA片段  如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)],如转基因,标准 品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合,然后抽提混 合DNA;切不可先抽好转基因DNA,再梯度稀释,也不可分别抽 提转基因与非转基因DNA,再按重量比例混合(这样得出的是 基因重量百分比,而不是样品重量百分比) 7 两种容易混淆的阴性对照 • 无模板的阴性对照 在反应体系中不加入核酸模板,而以水为替代的对照 目的:监控配制反应体系的试剂是否存在污染。 • 阴性样品的对照 在样品制备过程中,加入已知的阴性样品(或水),并将提取物作为模 板加入反应体系,参与整个实验过程。 目的:监控整个实验操作过程中是否存在污染。 8 设立各种PCR 对照的意义: 9 | Life Technologies Proprietary Confidential | 3/27/2014 设立阳性内对照(IPC)的意义 IPC可以起到阳性对照的作用,以监控反应系统是否正常 试剂、PCR程序、荧光采集、是否存在抑制物…… IPC可以校准实验过程对定量结果的影响 −

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