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定量PCR的试验要素和试验设计
定量PCR的实验要素
和实验设计
定量PCR 实验要素
2
定量PCR实验要素
检测对象 样品
标准曲线 标准品
监控系统故障 阳性对照
监控污染 阴性对照
校准生物学误差 阳性内对照 (IPC)
校准物理误差 参比荧光 (ROX)
降低其余误差 重复实验
3
对样品的要求
DNA纯度:OD260/OD280=1.8,1.6-2.0之间
DNA用量:0.05 ng-100 ng
RNA纯度:OD260/OD280=2.0
cDNA用量:1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1uL
样品中PCR抑制物尽可能少
核酸的完整度
样品的物理特性及合适的处理方法
4
标准品
目的:生成标准曲线,建立CT值与浓度之间的函数关系
要求:
选取具备代表性的标准品
CT = k lgX0 + b
组织样?灭活病毒颗粒?基因组DNA?质粒?
体外转录RNA?纯化的PCR产物?
绝对量已知(拷贝数、质量、浓度)
大于等于5个梯度稀释的标准品
标准品与待测样品的PCR效率一致,且接近100%
与样品的性质尽可能接近;
与样品相同的扩增条件(PCR体系、耗材、同一次扩增)
5
标准品的准备
选择目标→提取/PCR →纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释
所得CT值在18-30之间,覆盖全部样品浓度区间
10倍连续梯度稀释方法:
1. 原液(标准品i) +9v稀释缓冲液,得标准品ii
2. 标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii
3. 标准品iii +9v稀释缓冲液,得标准品iv
4. 标准品iv +9v稀释缓冲液,得标准品v
切不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接稀释为标准品
ii、iii、iv、v !
6
标准品的单位
标准品的单位决定样品定量结果的单位
根据最终目的选择标准品单位
如果要求测定样品的基因拷贝数,则梯度稀释已知摩尔浓度的
DNA片段
如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)],如转基因,标准
品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合,然后抽提混
合DNA;切不可先抽好转基因DNA,再梯度稀释,也不可分别抽
提转基因与非转基因DNA,再按重量比例混合(这样得出的是
基因重量百分比,而不是样品重量百分比)
7
两种容易混淆的阴性对照
• 无模板的阴性对照
在反应体系中不加入核酸模板,而以水为替代的对照
目的:监控配制反应体系的试剂是否存在污染。
• 阴性样品的对照
在样品制备过程中,加入已知的阴性样品(或水),并将提取物作为模
板加入反应体系,参与整个实验过程。
目的:监控整个实验操作过程中是否存在污染。
8
设立各种PCR 对照的意义:
9 | Life Technologies Proprietary Confidential | 3/27/2014
设立阳性内对照(IPC)的意义
IPC可以起到阳性对照的作用,以监控反应系统是否正常
试剂、PCR程序、荧光采集、是否存在抑制物……
IPC可以校准实验过程对定量结果的影响
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