第八章蛋白质的测定..pptVIP

本章重点 凯氏定氮法的原理及注意事项。 蛋白质快速测定法有哪些？ 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 第一节 概述 蛋白质是复杂的含氮有机化合物。 蛋白质换算系数F 玉米、高粱 6.24 花生 5.46 乳制品 6.38 大米 5.95 面粉 5.70 大豆及制品 5.71 肉与肉制品、复合配方食品、一般食物 6.25 蛋白质平均含N量（15-17.6）为16% 。 其中： 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等——多用于生产单位质量控制分析。 国外：红外分析仪 在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。 第二节 蛋白质的定性测定（自学） 一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法） 第三节 蛋白质的定量测定 （一）常量凯氏定氮法 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ①　用H3BO3吸收后再以标准HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ②　也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 1. 消化 2 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 2. 蒸馏与吸收消化液 + 40%氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。 “以奈氏试剂”检查。 3. 滴定 用HCl滴定 用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红） 终点：蓝色→微红色 说明及注意： ①本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗蛋白质）。结果准确，但费时。 ②所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ③同时作一空白试验，从消化开始到滴定。 ④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。  ⑤ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 ⑥ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑦ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。 ⑧ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑨蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸现象。 （二）微量凯氏定氮法 1、原理、步骤及适用范围同前 2、与常量法不同点：样品量、试剂用量 减少 加入硼酸量由50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见下图 。 （三）自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。 二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 快速方法： 双缩脲法 紫外分光光度法 染料结合法 水杨酸比色法 红外光谱法 考马斯亮蓝染料比色法 …… 1.原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时，两分子缩合成双缩脲。 注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化可直接用粉样，振荡、显色后离心。  2. 方法特点及应用范围