第五章5表达目产物的分离纯化108.pptVIP

（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则 （二）透析和超滤 （三）离子交换层析 （四）凝胶层析 （五）亲和层析 （六）重组蛋白的质量检测 4、亲和层析的基本操作 采用改变pH、离子强度、离子种类、温度，使与固定配基结合的生物大分子构象发生变化，降低其亲和力。 1）非专一性洗脱 使用广泛的是改变溶液的离子强度。 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH + - 蛋 白 质 净 电 荷 等电点 吸附阴离子交换剂 吸附阳离子交换剂 pHpI（+） pH=pI（0） pHpI（-） 对pI=5的某蛋白质： 在pH5.5-9.0范围内，蛋白质为阴离子， 首选DEAE纤维素。 在pH3.5-4.5范围内，蛋白质为阳离子， 首选CM纤维素。 层析柱平衡 平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍； 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速； 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要。 4、离子交换层析的基本操作 样品进柱 交换容量： 离子交换剂中可交换的离子或功能基团的总数。 为达满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%。 为避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高。 样品洗脱 恒定洗脱 梯度洗脱 线性洗脱 10 20 30 40 50 60 70 80 90 分子浓度 离子强度 pH值 凝胶层析的基本原理 凝胶介质的基本性质 凝胶介质的选用原则 凝胶层析的基本操作 1、凝胶层析的基本原理 凝胶层析是以有一定孔径范围的多孔凝胶为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称分子筛。 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶颗粒内部，迁移速度慢。 1、大分子物质不能进入凝胶颗粒内部，随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，迁移速度快； 原理： 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即使大小不同，也不能分开，它们的下行速度快。 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙，即使大小不同，也不能分开，它们的下行速度慢。 注意： 2、凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶对碱稳定，在酸性环境中糖苷键易水解；湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的能耐受120℃高温。 1）葡聚糖凝胶 种类有Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50表示1g干凝胶吸水量为5ml。 Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。 Sepharose：Sepharose 2B、4B、6B （数字代表干胶的百分比） Bio-Gel-A：Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、 50M、150M （数字×106代表排阻限度） 2）琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶是从琼脂中分离出的天然凝胶，常见的有： 温度高于50℃时，琼脂糖凝胶融化，只能在较低温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，适于分离分子量较大的生物大分子（如蛋白质、DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联琼脂糖，孔径大小和分离范围同普通琼脂糖，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。 聚丙烯酰胺凝胶商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（数字×1000为排阻限度）。 3）聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位、由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶。 控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多、孔隙越小。 3、凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子和小分子物质分开，称为组别分离，分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 1）组别分离 一般选Sephadex G-25或G-50，对于小肽和小分子物质的脱盐，可选Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4。 将样品中一些分子量较接近的物质分开，称为分级分离。 2）分级分离 一般选排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。样品中各组份均能不同程度地深入凝胶内部，由于深入凝胶空隙