蛋白纯化方法选择.PDF

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 蛋白纯化方法选择 蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来 ，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整 性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务 ，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白 制品的纯度。 蛋白纯化方法 蛋白纯化的原理为 ：不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同 ，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异 ， 利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异 ，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。 蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如 RNA、 DNA 等分开 ，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白 区分开来 ，常用的方法有 ：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。 凝胶过滤层析 凝胶过滤 （也叫排阻层析或分子筛 ）是一种根据分子大小从混合物中分离蛋白质的方法。不同蛋白的形状及分子大 小存在差异 ，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时 ，由于各 种蛋白的分子大小不同 ，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异 ， 大的蛋白分子会被先洗脱出来 ，分子越小 ，越晚洗脱 ，从而达到分离蛋 白的目的。一般来说 ，凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。凝 胶过滤层析详细介绍 凝胶过滤层析所能纯化的蛋白分子量范围很宽 ，纯化过程中也不需要能 引起蛋白变性的有机溶剂。缺点是所用树脂有轻度的亲水性 ，电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面 ，不适宜纯化电 荷密度较高的蛋白。 离子交换层析 离子交换层析是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷 ，电 荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面 ，在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 子与固定相之间的结合作用是可逆的 ，在改变 pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时 ，离子交换剂上结合的 物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同 ，其与离子交换剂的结合能力也不 同 ，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同 ，从而达到分离的效果。离子交换色谱的基本原理及实验操作 图 2 ：离子交换层析纯化蛋白 亲和层析 亲和层析纯化是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可 逆结合的特性进行蛋白纯化的技术。该方法 适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物 ，具 有分离效果好、分离条件温和、结合效率高、分离速度快的优点。亲 和层析技术可以利用配基与生物分子间的特异性吸附来分离蛋白 ，也 可以在蛋白上加入标签 ，利用标签与配基之间的特异性结合来纯化蛋白。 配基与生物分子之间的特异性吸附 配基 ：在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基。配基可以是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体等。 亲和层析是根据固定相的配基与生物分子之间的亲和能力不同来进行相互分离的。依据选择性的高低亲和层析可以 分为基团性亲和层析及高选择性 （专一性 ）亲和层析。基团亲和层析一种配基可以吸附多种蛋白 ，如以三嗪染料为 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB