第三章 细胞生物学研究方法1..pptVIP

线虫的基因组于1998年测序完成，是人类得到的第一个动物物种的基因组,共有109个碱基对，约含18400个基因。 果蝇的基因组于2000年测序完成，共有1.4×109个碱基对，约含13600个基因。 小鼠的基因组测序工作预计到2007年完成，推测其基因组共有3.3×1010个碱基对，约含40000个基因。 * DNA特异性的显示方法 Feulgen反应： 利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。 多糖的显示方法 PAS（过碘酸希夫氏）反应 利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C-C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。 脂类物质的显示方法 对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。 细胞中各种酶的显示方法 由于酶易受外界条件影响而变性失活。 对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。 在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 ?免疫电镜技术： ?免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。 细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。 抗原 抗原抗体 特异性结合 免疫荧光标记 免疫酶标记 免疫荧光技术 免疫电镜技术 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） 　　　　　 ?PCR技术 五、放射自显影技术 ?原理及应用： ?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤： ?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影 放射自显影 六、定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度测定术 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法；可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry） 主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。 流式细胞仪 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。近年来细胞生物学一系列主要理沦研究的进展，如细胞全能性的揭示，细胞周期及其调控。癌变机制与细胞衰老，基因表达与调控，细胞融合以及一些细胞工程技术的建立都是与细胞培养技术分不开的。 1、动物细胞培养 ?类型：原代培养细胞；继代培养细胞 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失 2、植物细胞 ?类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） 动物细胞培养 植物组织培养 二、细胞工程 ?细胞融合与细胞杂交技术 ?单克隆抗体（monoclone antibody）技术 ?细胞拆合 ?物理法结合显微操作技术(图1、图2) ?化学法结合离心技术 ?制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 ?显微操作技术 细胞融合 单克隆抗体 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术，因此获得1984年诺贝尔医学奖。 乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。 Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana 拟南芥菜 酵母的基因组于1996年测序完成，其基因组含1.2×108个碱基对，约有6200个基因。 模式植物 拟南芥菜 植株小 -15 cm 种子多- up to 1