第2章 生化制药基本技术.pptVIP

第二章 生化制药的基本技术 第一节 原料的选择、处理及有效成分的提取 一、原料的选取与保存 二、生化药物提取 2. 提取的溶剂系统 三、细胞破碎技术 珠磨法 bead mill 珠磨是常用的方法 **细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 四、固液分离 第二节 沉淀技术 一、盐析法 二、有机溶剂沉淀法 三、等电点沉淀法 第三节 色谱技术 二、柱色谱装置和操作 柱色谱操作 三、吸附色谱 四、凝胶过滤色谱 2. 凝胶的种类和性质 3. 凝胶色谱的应用 五、离子交换色谱 六、亲和色谱 第四节 结晶 结晶的过程 二、结晶的过程 2. 晶核的形成 3. 晶体的生长 三、晶体质量控制 四、结晶的应用 第五节 电泳 电泳的类型 二、琼脂糖凝胶电泳 操作步骤 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相 溶 胶 准备胶槽 凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml 铺 胶 凝胶凝固后取出梳子 加缓冲液 准备样品 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 紫外灯下观察电泳结果 照 相 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS.分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 3.浓缩胶的制备 用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。 二、样品处理与加样 1.样品处理 2.加样 小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用 微量进样器点样 三、电泳 接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开开关，保持恒压进行电泳。 流程图 五、等电聚焦 第六节 蒸发与干燥 二、干燥 聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由N，N′-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。 丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢神经毒物。N，N’-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为170mg/㎏，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。 聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N′，N′-四甲基乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚合。 聚丙烯酰胺凝胶制胶装置 实验步骤 一、制胶 1.配胶 配胶应根据所测蛋 白质相对分子质量范 围选择适宜的分离胶 浓度。由于SDS有连续体系和不连续 体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而 有不同的配制方法。（以不连续体系为例） 2%～5% ＞5×105 5%～10% 1×105～5×105 10%～15% 4×104～1×105 15%～20% 1×104～4×104 20%～30% ＜104 分离胶的浓度 蛋白质的相对分子量的范围 4.60 5.20 8.54 10.20 11.87 重蒸馏水 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 0.10 2.00 0.20 - - 2.50 10.00 15% 0.05 0.10 0.10 0.10 10%AP 2.00 2.00 2.00 2.00 1%TEMED 0.10 0.20 0.20 0.20 10% SDS 1.25 - - - 浓缩胶缓冲液 （pH6.8Tris-HCl） 3.0 - - - 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） - 2.50 2.50 2.50 分离胶缓冲液 （pH8.8Tris-HCl） - 6.66 5.00 3.33 分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 3% 10% 7.5% 5% 配制10ml浓缩胶 所需试剂用量 配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml 试剂名称 样品 溶解 沸水浴 冷却 加样 样品迁移方向 样品溶解液 慢 中等 快 柱分离 淋洗液 固定相：固体为吸附剂，如硅藻土、硅胶、氧化钙、淀粉、活性炭等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用吸附剂对不同物质的吸附能力不同而使混合溶液中各组分相互分离的