基因的高克隆2.pptVIP

重组子的筛选与鉴定 几种常用的重组ＤＮＡ分子的筛选方法：　　　　　 　１．抗药性标记插入失活标记法 　２．?－半乳糖苷酶显色反应筛选法 　３．原位杂交 　４．免疫法筛选 抗药性标记插入失活标记法 目的基因插入到抗四环素基因的位置，则导入菌体后的菌株则不能在有四环素的培养基上生长 ↙ ?－半乳糖苷酶显色反应筛选法 多克隆位点 完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。 当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，使得菌落呈现蓝色。 X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷 表示外源基因插入编码半乳糖苷酶的基因区段 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落 使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。 对照目的基因本身不能是培养基变色 原位杂交 生长在琼脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝酸纤维素膜上，加入放射性的探针　（即带有 放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌落杂交。经洗涤后的膜与X－光胶片作用，挑选出阳性克隆。 免疫法筛选 原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌落。 方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该抗体可携带酶或荧光，易于检测。 基因表达产物的鉴定 基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译成蛋白质的过程。 DNA RNA Protein 转录 翻译 研究基因表达的手段 1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质） 1、RT-PCR 　基本原理： 　　　　　将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。根据PCR产物的量，判断基因表达的强度。 mRNA cDNA PCR产物 2、Northern blot 标记探针与膜固相RNA杂交。 根据杂交信号强弱判断表达量， 根据杂交信号位置判断分子长度。 实验操作：1）RNA提取　2）RNA电泳（分离不同长度RNA)　3）转膜 (形成固相RNA)　4）探针标记（同位素/非同位素）　5）杂交　6）洗膜　7）显影（放射性/酶促反应） 优点：因为没有扩增过程，Northern blot 的结果可靠性高。可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。 缺点：1、操作烦琐　2、使用同位素可能污染环境　3、灵敏度低　4、对RNA质量要求高 ３、 Western blot 标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。 根据信号强弱判断蛋白表达强度。 根据信号位置判断蛋白分子量。 标准分子量 蛋白 特异性反应带 优点： 直接检测蛋白质的表达量。 缺点： 灵敏度低 一抗制备难度大，购买价格高 氨基酸序列测定 测定N端的10－15个氨基酸 测定C端的5个氨基酸 样品需精制 价格较高 谢谢大家 基因工程 基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。 克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性繁殖的单一原型细胞。 基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片段产生出很多相同拷贝的过程。 目的基因的表达 连接产物导入受体细胞 目的基因与载体连接 获取目的基因 得出结论 步骤三： 步骤二： 步骤一： 基因克隆的技术路线的大体步骤 一、获取目的基因 从染色体中获得目的基因 1.基因组DNA的随机断裂片段 2.限制性内切酶切割基因组DNA 3.用反转录法合成cDNA 人工合成 PCR扩增特定的目的基因片段 基因克隆的载体 载体满足的几个要求： 1.分子相对较小（3～10Kb）能进行复制且具有高度拷贝数 2.具有几个单一的酶切位点，便于所要DNA片段能够连接、插入载体，酶切位点应该在载体复制子意外适当的位置。 3.外源性DNA插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。 4.载体本身应对受体细胞无害，以及能接纳尽可能大的外源性DNA片段。 5.有便于筛选的明显标志，以便于阳性克隆细胞容易被选出 6.具有促进外源性DNA表达的调控区。 7.生物防护安全，不污染