nSMOL前处理技术结合Skyline软件.PDFVIP

nSMOL 前处理技术结合 Skyline 软件 加速抗体药物 LCMS分析方法开发 摘 要：本文利用 nSMOL 前处理试剂包结合 Skyline 软件，加速抗体药物 LCMS 方法开发 过程，仅在一个工作日就可以完成单个抗体药物 LCMS 方法的初步优化。实例中贝伐珠单 抗共筛选出 9 个肽段具有典型色谱峰，其中 4 条肽段与贝伐珠单抗的 Fab 区域相关，并且这 4 条 Fab 区域的肽段响应远高于其他肽段；曲妥珠单抗共有 10 个肽段具有典型色谱峰，其 中 8 条肽段与曲妥珠单抗的 Fab 区域相关。实验证明，利用 nSMOL 技术可以选择性酶解 Fab 区域，从而降低抗体药物定量肽段开发的复杂性。 关键词： nSMOL 三重四极杆质谱 Skyline 贝伐珠单抗 曲妥珠单抗 方法开发 LCMS 技术分析蛋白药物或者蛋白标记物，通常需要经过胰酶酶解过程，获得的酶解混 合物经过净化后再分析。复杂生物基质例如血浆、血清中目标抗体药物若采用传统酶解方式 或 Pellet 酶解方式，获得的酶解产物均为多种肽段的混合物。结合 LCMS 分析的特点，在方 法开发的过程中需要针对酶解的备选肽段进行 MRM 通道的筛选和优化，酶解产物越复杂在 方法开发过程中所消耗的时间越长。随着技术的发展，我们发现通过纳米表面限制性和导向 性酶解抗体药物实现 Fab 区域的选择性酶解技术（nSMOL ）处理抗体，可以尽可能降低对 非特异性区域例如保守区域的酶解，从而极大地减少了酶解肽段的数量，进一步的 LCMS 方 法开发过程大为简化。 与传统的基于经验筛选蛋白特征肽段的过程不同，岛津公司将其超快速液相色谱-质谱 联用平台和强大的 Skyline 定量蛋白质组学软件集成一体。Skyline 软件为蛋白质定量的研究 工作提供了标准化的工作流程，使得方法开发工作不再过度依赖研究人员的经验，降低了肽 段筛选和 MRM 通道分析条件优化的复杂程度。 本文利用nSMOL 前处理试剂包结合 Skyline 软件，加速抗体药物LCMS 方法开发过程， 仅在一个工作日就可以完成单个抗体药物的 LCMS 方法的初步优化，与传统的 ELISA 方法 需要制备特异性免疫试剂进行检测消耗的时间比，本方法极大地缩短了方法开发的过程，更 灵活快速应对抗体药物和生物类似药的临床前及临床研究等不同阶段生物分析的需求。 1 1. 实验部分 1.1 仪器和试剂 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。 具体配置为 LC-30AD×2 输液泵，DGU-20A5 在线脱气机，SIL-30AC 自动进样器，CTO-20AC 柱温箱，CBM-20A 系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.82 SP1 色谱工作站，Skyline Ver.3.5.0.9319 软件，nSMOL 前处理试剂盒。 1.2 分析条件 液相条件 色谱柱：Waters BEH Peptide C18 流动相：A 相-0.1% 甲酸水溶液 2.0 mm I.D.× 150 mm L., 1.7 μm B 相-0.1% 甲酸乙腈 流速：0.4 mL/min 柱温：40 ℃ 进样量：10 μL 洗脱方式： 梯度洗脱，B 相初始浓度为 5%，洗脱程序 0.0-3.0 min，5%；3.0-35.0 min，5%~40%； 35.0-37.5 min，40%~95% ；37.5~45.0 min，95% ；45.5-50.0 min, 5% 。 质谱条件 分析仪器：LCMS-8060 干燥气：氮气 5.0 L/min 离子化模式：ESI (+) 碰撞气：氩气 离子源接口电压：1.0 kV 源温度：300℃ 加热气：空气 15.0 L/min DL 温度：250 ℃ 雾化气：氮气 3.0 L/min 加热模块温度：400 ℃ 扫描模