分子生物学最重要的几个实验.pptVIP

分子生物学实验 一. 实验目的及背景 高等动物，高等植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对，水稻基因组有１．４×１０９个碱基对。真核细胞基因组中，约１万－１．５万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。 * * 实验一 植物基因组DNA的提取 实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶 电泳检测 实验三 植物总RNA的提取 实验四 蛋白质印迹 实验一 植物基因组DNA的提取 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液:CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5MEDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 （1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管， 剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时， 将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； （8）10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜， 转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动 30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 μl的75%乙醇及 80 μl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使 沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿 将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体， 再加入800 μl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min； （13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液 体，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自 然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 μl