第六章-基因来表达调控.pptVIP

操纵子的实验、种类及生物学意义 （Operon, species and biological significance of the experiment） 本章主要内容 基本概念与原理 原核生物基因转录调控 操纵子的种类 一、操纵子的概念 是由功能上相关联的多个编码序列（2个以上）及其上游的调控序列（包括操纵序列、启动序列和调节序列）等成簇串联在一起，构成的一个转录协调单位。 原理：当乳糖存在时，该酶分解乳糖。当乳糖不存在时，阻遏基因产生阻遏蛋白，结合到操纵子基因上。这种结合阻挡了结构基因的表达，使不产生分解乳糖的酶。但是，当环境中存在乳糖时，乳糖分子结合到阻遏蛋白的底物上，阻止了阻遏蛋白和操纵基因的结合。操纵基因现在自由了，它将不阻挡结构基因表达。 1940年，Jacques Monod开始研究E.coli 进行乳糖代谢的一些特征研究，观察到乳糖和其他半乳糖苷可以诱导β-半乳糖苷酶的产生。他和MelvinCohn用抗β-半乳糖苷酶抗体检测酶蛋白，发现诱导后酶量增加。 进一步研究发现事情更复杂。一些神秘的突变株“cryptic mutants”能产生β-半乳糖苷酶，但是却不能在以乳糖为碳源的培养基中生长。这是什么原因呢? 为了回答这个问题，他们用放射性标记的半乳糖苷进行研究。发现野生型菌在乳糖诱导后会摄取半乳糖苷，而这种突变型菌不能。 -Lactose +Lactose Wild strain - + Cryptic mutant - - 这个实验结果有什么提示呢？ 1）在野生型菌中，有一种物质与β-半乳糖苷酶一起被诱导，它负责输送半乳糖苷进入细胞。 2）突变株中，这种物质的基因被破坏。 Monod和同事努力分离纯化得到了半乳糖苷透过酶。在这个过程中，他们还分离到了另一个蛋白：半乳糖苷转乙酰酶，该酶与β-半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶一起被诱导。 这样，到了50年代末，Monod已经知道有三种酶共同被半乳糖苷诱导。他们也发现了一些组成型突变株，不需要诱导就可以产生这三种酶。Monod认识到用遗传学分析可以加快实验进展，所以与同在Pasteur Institute工作的Francois Jacob开展了合作研究。 阻遏的机制Barbara Krummel and Michael Chamberlin提出一种解释：R阻断了起始转录复合物向延伸状态的转变。换句话说，R把RNAP困在起始状态，只能合成很短的转录体。Jookyung Lee and Alex Goldfarb为这一解释提供了实验证据。应用了run-off转录方法，使用一旦123bp DNA（含lac控制区和lacZ基因的起始部分）。先将R与DNA一起孵育10min，让R-O结合。再加RNAP，20min后（让开放型启动子复合物形成）加heparin。Heparin能与游离的RNAP或与DNA结合不紧密的RNAP结合，抑制RNAP与启动子结合。然后加入RNAP反应的其他成分，但不包括CTP。5min后，加入α-32P-CTP及IPTG，并设立不加IPTG对照。反应10min后，通过电泳观察是否发生run-off转录。实验结果显示，确实观察到了转录题。因此，R不能抑制RNAP与laP之间的紧密结合。实际上lac操纵子有3个operator。除了主要的O1，还有两个辅助的O，一个在上游，一个在下游，都与阻遏作用有关，但O1起主要作用。两个O之间可以通过R相互作用。 Lac操纵子的正调控当E.coli在含葡萄糖和乳糖的混合碳源培养基中生长时，菌体首先利用葡萄糖，仅当葡萄糖消耗完后才利用乳糖。在葡萄糖存在时，即使无阻遏物存在（lacI-），lac基因也不表达。进一步研究表明，葡萄糖对lac基因表达的抑制是间接的，是葡萄糖的某些代谢产物抑制了lac基因表达，因此这种效应被称为代谢物阻遏效应（catabolite repression）。 二、诱导和阻遏表达 诱导表达 在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。 阻遏表达 如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。 三、协调表达 协调表达 在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，