高效液相色谱法讲义包含前讲义和实验.docxVIP

高效液相色谱仪在基础有机化学实验产物分析中的应用 第一部分：基础理论部分 一、色谱法简介 1. 色谱法简史 1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）的概念。他在论文中写到：“（原文）植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就像光谱一样，称之为色谱图。” 2. 色谱法分类 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制的不同，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。 （1）吸附色谱 吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。 （2）分配色谱 分配色谱是利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱的色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。 （3）离子交换色谱 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。 （4）凝胶色谱 凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小;改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。 二、高效液相色谱法简介 1. 高效液相色谱发展背景 液相色谱法发展初期是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。一句话，高效液相色谱是以高柱效小颗粒填料为载体，以高压泵为流动相驱动力，对物质进行快速分离和分析的方法。 2. 高效液相色谱的特点 高效液相色谱的“高效”主要体现在以下“四高”： （1）高压 流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 （2）高速 分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 （3）高效 分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 （4）高灵敏度 紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。 三、高效液相色谱的组成 1. 系统结构简图（以安捷伦1220为例） 如上图所示，高效液相色谱主要有储液瓶、高压泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱工作站组成。 2. 储液瓶和脱气机 主要用于存储流动相（溶剂或缓冲液）和除去流动相中的气泡。 流动相进入高压泵之前必须脱气（脱气机一般包含在高压泵组件中），尤其是水和极性溶剂。否则气泡进入色谱柱以后，将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。 3. 高压泵 色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输液。高压泵是高效液相色谱的关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。 高压泵分为两类：恒流泵和恒压泵。恒流泵：柱阻力变化，流动相粘度变化，引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。恒压泵：流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，例如装柱用的气动泵。HPLC 广泛采用往复柱塞泵，由液