溶血空斑实验..pptVIP

抗体生成细胞检测 ——溶血空斑实验 微生物与免疫教研室 实验目的 掌握溶血空斑试验检测原理 掌握溶血空斑的操作方法 实验原理 ●溶血空斑实验（plaque forming cell assay,PFC ） 体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法。 ●其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，在37℃条件下免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。 ●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞 ），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。 实验材料与试剂 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.00×109个/mL ②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min 实验步骤 ㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108?个/1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中，2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为5×106个/ml） （二）倾注底层琼脂 将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴锅中预温。 （三）表层琼脂的制备 将0.7%的琼脂融化后，置于55℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂： ⑴ 20%SRBC悬液0.1ml。 ⑵ 小牛血清0.1ml。 ⑶ 5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。 迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37℃温育2h。 （四）加补体 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，次日观察结果。 结果判定 ? 观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。? 注意事项 ⒈?对SRBC的要求：因为SRBC既是免疫原，也是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜，洗涤不超过3次，每次2?000r/min离心5min，细胞变形或脆性增大者均不能使用。 2．免疫所用SRBC的数量：尾静脉注射以2.00×104?个/0.2ml为宜。腹腔注射为4.00×108?个?/ml，用量小，如低于1.00×107个/ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超过2.50×109个/ml，不能形成空斑。 3．采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或过晚空斑都形成极少。 4．脾细胞的活力：?为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液），最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。 5．倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。 6．补体的活力：补体活力的大小，对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下，将不能形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。 7．空斑计数：要求判读准确，避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，对肉眼结果进行核对。 所以器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温。 SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须准确。 免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个体差异大，难以比较，最好先作几次预实验，使每个玻片空斑数控制在100-200个为宜。 思考题 溶血空斑实验的意义？ * *