江浙蝮蛇毒ix因子结合蛋白ahp ix-bp和尖吻蝮蛇毒锌金属蛋白酶aah iv自降解产物d是c-motifacucetin的结构和功能关系研究.docx

博=I’论文 博=I’论文 摘 要 摘 要 1、蝮蛇毒Ix因子结合蛋白(AHP IX-bp)的纯化、生化性质鉴定、eDNA序列测定、 晶体生长和结构分析研究 AHP IX．bp是从江浙蝮蛇毒中纯化得到的一种新的凝血因子Ix结合蛋白。是由一对 二硫键连接的异源二聚体，分子量为25 kDa左右，A亚基的分子量为15．5 kDa，B亚基 的分子量为l 5 kDa。测定了AHP IX-bp的N．端氨基酸残基序列以及它的部分eDNA序列。 序列比较结果显示，AHP IX．bp和其它蛇毒C．型凝集素类似蛋白的序列同源性很高，并 且AHP IX．bp能结合IX因子，不能结合X因子，因此AHP IX，bp是一种从蛇毒中分离 得到的新的Ix因子结合蛋白。比较AHP IX—bp和其它蛇毒来源的IX／X因子结合蛋白的 氨基酸序列显示，IX／X因子结合蛋白序列主要的差别在A56-A67，这一区域的氨基酸残 基的差别可能与IX／X因子结合蛋自识别配体的差异性相关。AHP IX．bp与Ix因子的结 合具有锌离子和pH依赖性，在中性或弱碱性条件下，AHP IX．bp与lx因子的结合能力 比弱酸性条件下强得多。为了阐明AHPIX．bp和IX因子结合具有pH依赖性的机理，分 别在pH 6．5和7．5条件下进行AHP IX-bp的晶体生长实验，获得了可用于X．射线衍射的 单晶，并分别收集了2．0A和1．8A的衍射数据。用分子置换法解决了相位问题，测定了 AHP IX．bp在两种不同pH条件下的结构。在pH 6．5和7．5两种结晶条件下，AHP IX．bp 的整体结构很相似，均方差仅为0．122 A，但在pH 6．5条件的晶体结构中，His B61具有 双重构象，这种结构的变化可能与AHP Ix-bp活性的pH依赖性相关．AHP IX．bp在两个 不同pH条件下结构的差异揭示了IX／X因子结合蛋白与配体结合pH依赖性的结构基础． 2、尖吻蝮蛇毒出血毒素IV降解产物acucetin的纯化、部分序列测定、性质鉴定和初步 晶体学研究 AaH IV是Agkistrodon acuttls蛇毒中一种P．III型的金属蛋白酶，该蛋白在370C、中 性或弱碱性条件下，能很快地发生自降解反应，生成一个稳定的降解产物，命名为 aeucetin，其分子量约为30 kDa。测定的Acucetin的部分序列显示aeueetin没有金属蛋白 酶结构域，与从蛇毒中分离得到的含有类去整合素结构域和富含半胱氨酸结构域的蛋白 序列同源性很高，acueetin也含有类去整合素结构域和富含半胱氨酸结构域。研究发现将 反应体系的pH降低到弱酸性范围，AaHIV的自降解速度显著减缓。在pH4．0条件下， 能分离得到分子量约为43kDa降解中间产物。Aeueetin能抑制ADP和胶原诱导的血小板 聚集。在硫酸铵体系中获得了Aeueetin的晶体，空间群为飓2，晶胞参数为a=b=155．98A、 c=76．OTA，％为2．97 A3／Da，一个独立区仅有～个aeueetin分子。获得Acucetin晶体的 衍射数据为结构的解析奠定了基础． 博1：论文 博1：论文 摘 要 ABSTRACT 1．Purification，partial characterization，cDNA sequencing。crystallization and structure determination of AHP IX·bp，a new coagulation factor IX-binding protein from the Agkistrodon halys Pallas venom． A new coagulation factor IX-binding protein，AHP IX·bp，has been purified from Agkistrodon halys Pallas venom and estimated to be a AB．heterodimer of about 25 kDa consisting of two chains(A—chain of 1 5．5kDa and B-chain of 1 5kDa)linked by disulfide bond(s)．N-terminal sequence and partial cDNA sequence