第3章基因组学、蛋到白组学.ppt

病毒基因组结构 SV40病毒转录后加工 二、几种典型的病毒基因组 HBV DNA复制周期 二、几种典型的病毒基因组 蛋白质组 protein + genome proteome 一种基因组所表达的全部蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质 蛋白质组及其质点的分离与纯化 （二）盐析法 根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法 盐析（salting in）：蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐浓度的升高而增加。这是由于少量盐类离子与水分子影响蛋白质分子上的极性基团，使其溶解度增大。 盐析（salting out）：当盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。 （三）电泳技术 原理：利用蛋白质分子所带电荷不同或分子大小及形状不同，在外界电场的作用下，蛋白质带电粒子在电场中具有不同的泳动速率而进行的分离。 电泳介质：聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液 电泳类型：板状或管状聚丙烯酰胺凝胶电泳/毛细管电泳；分析型凝胶电泳/制备型凝胶电泳 （四）层析技术 又称分子筛层析 是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一 常用的分子筛填充物：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶。凝胶颗粒形成不同交联度的网状结构。 分离原理：不同分子大小的蛋白质在重力作用下通过凝胶颗粒，不能进入“网眼”的大分子蛋白由于路径较短首先被洗脱出来；小分子蛋白能进入“网眼”路径较长则后被洗脱出来。 填充剂：离子交换树脂（剂），分为阴离子交换剂（带正电荷，能结合阴离子）、阳离子交换剂（带负电荷，能结合阳离子） 原理：带电荷的蛋白质由于所带电荷数不同，对交换剂的亲和力出现差异，通过离子交换与洗脱，使不同的离子先后被洗脱下来，达到分离的目的。 原理：利用生物大分子具有与其结构相对应的分子（酶-底物、抗原-抗体、配体-受体、生物素-亲和素等）发生可逆性特异结合的特性达到专一的分离。 固定相：结合有亲和物的不溶于水的固相支持物 流动相：含有与亲和物匹配的待分离物缓冲液。先用流动相洗去杂质，再用特殊流动相解离待分离蛋白。 （一）Western印迹杂交 2-DE图像分析软件包操作过程： 2-DE获得的蛋白质图谱 Edman降解法是用异硫氰酸苯酯在弱碱条件下与肽段N端α-氨基结合生成苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽），然后在酸性条件下经环化、水解处理，生成苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa)　和失去原N-端氨基酸的肽。剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-AA，经层析鉴定就可从N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序。 N-末端Edman化学降解法测序原理 常用的质量分析器 飞行时间质谱（time of flight-MS） 四极杆质谱（） 蛋白质芯片 DNA-BD和DNA-AD分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。 只有当蛋白质X与蛋白质Y间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能 。 凝胶滞后试验 滤膜结合法 甲基化干扰 DNaseⅠ足纹 核酸-蛋白质杂交实验 MALDI-Tof 的典型结果 MALDI-TOF检测的多肽指纹 tryptic digestion Gel Protein Database ? 1 2 3 compare: ?? is identical to ?? mass spectrometry stored data or theoretical peptides ESI 四极质谱原理 Nano electrospray: 30 min spray time for 1 mL sample Highly charged molecules are selected by ac modulation of transverse fields 四极质谱过滤 鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 ESI Quadrupole MS 的典型结果 3倍 四极质谱分析仪 CID: Collision Induced Dissociation for acquiring Molecular weight and Structural information Q-TOF 质谱分析仪 CID 片段的命名法 CID 质谱 商品化的 LC/MS/MS API 4000, API Q-Tof ultima API, Micromass HCT plus, Bruker LC/MS/MS解释的结构信息 P