第六章外源基音因的表达.pptVIP

第六章 外源基因的表达 （2）真核生物基因表达系统 转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。 mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构。 为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌。 以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是： 易于分离纯化。因为包涵体的水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他蛋白区分开来； 对蛋白酶表现出好的抗性。 密码子 链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。 编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达73％，密码子的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别达66％、53％和93％，而该现象不存在于非编码区。 在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于2％。 密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般C的频率明显高于G的频率。 2、宿主菌 变铅青链霉菌 天蓝色链霉菌——是整个链霉菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。 主要有 变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点： 遗传背景清楚，不含内源性质粒； 对外源DNA无明显的修饰作用； 能高效表达链霉菌基因以外的其它基因； 具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。 四、蓝藻表达系统 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。 蓝藻与真核生物藻类最大的区别是：它无叶绿体，无真核，有70S核糖体，细胞壁中含有肽聚糖，因而对青霉素和溶菌酶十分敏感等。 1、蓝藻外源基因表达载体 穿梭质粒表达载体 基因整合平台系统供体质粒表达载体 为使外源目的基因在蓝藻细胞内能高效表达，表达载体上组装了含有不同启动子的基因表达盒 2、用作外源基因表达的宿主蓝藻 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点： 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。 细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。 蓝藻在各生长时期均处于感受状态，均可用于转化，但通常采用对数生长中期到后期的细胞进行转化。转化过程中遮光或添加光合作用抑制剂可提高转化效率。 大肠杆菌SD序列的碱基组成为 5 ′AGGAGG 3 ′,其中以GGAG四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降。 ② 翻译起始密码子 起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。 也有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如GUG、UUG等。 ③ 翻译终止密码子 翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。 在大肠杆菌中，合成多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控， RF1识别终止密码UAA和UAG， 而RF2识别终止密码UAA和UGA，由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。 在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。 不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的选择性。有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为主密码子，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为罕用密码子。 如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。 2、宿主菌 重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因： 大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统 大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子 大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。 常见的大肠杆菌基因表达受体菌株 3、常见的大肠杆菌表