皮肤毛囊神经嵴干细胞的黑素定向分化和衰老机制研究-皮肤病与四性病学专业毕业论文.pdf.docxVIP

复旦大学 博士学位论文 皮肤毛囊神经嵴干细胞的黑素定向分化和衰老机制研究 姓名：姜敏 申请学位级别：博士 专业：皮肤病与性病学 指导教师：项蕾红 201104 D D udan 博士研究生学位论文 皮肤毛囊神经嵴干细胞的黑素定向分化和 衰老机制研究 中文摘要 关键词：毛囊；神经嵴千细胞；黑素分化；衰老 中图分类号：R75 研究背景 白癜风是表皮黑素细胞IMC)毁损导致的获得性色素脱失性皮肤病。虽然该病 并不影响个体生存，但可严重损害容貌外观，妨碍工作、学习、婚恋等社交活动， 导致沉重的精神和经济负担，甚至发展成为心身性疾病，威胁家庭和睦及和谐社会 的构建。但棘手的是，由于其病因复杂、确切机制尚不明了，目前沿用的治疗方法 效果尚不完全令人满意。因此，进一步阐明白癜风的发病机理对于寻找新的治疗 靶点有着至关重要的意义，其中从干细胞生物学的角度出发，探索皮肤干细胞一 MC分化和增殖的调控机制将会是个有益的尝试。 研究对象 皮肤干细胞是真、表皮及附属器中处于未分化的原始阶段、能进行自我更新、 同时也可分化成特定组织类型的“种子细胞。其中，神经嵴干细胞(NCSC)是 源自胚胎神经板的多能干细胞，其迁移并定居在毛囊隆突、毛乳头和真皮，形成了 皮肤黑素细胞、感觉神经元和施万细胞、真皮间质细胞等成分。因其强大的迁移 分化和再生修复能力，NCSC是维持皮肤微环境稳态的重要力量，更是色素形 成、毛发生长、创伤愈合等生理J／病理功能的细胞学基础。因此说，对于皮肤病特 别是色素疾病的基础研究，NCSC是个提纲挈领的切入点；对指导临床实践和开 发新疗法，这也极具运用前景。 ．3． Dudan Dudan 博士研究生学位论文 研究结果 一、毛囊NCSC的分离培养和鉴定 干细胞龛是成体干细胞在体内集中存储的部位，它是由特定的基质细胞和细 胞外基质共同构成的特殊微环境，毛囊隆突是皮肤NCSC最主要的龛之一。 本课题以小鼠触须为研究模型，采用显微外科方法分离隆突，探索并优化 NCSC的培养方法。这些隆突来源干细胞具有很强的自我更新，增殖能力，能在无 血清培养基中呈悬浮的克隆性生长，形成三维球体结构Bulge sphere。免疫荧光 染色和RT-PCR显示，它们表达多种NCSC标志物如p75、Soxl0、Nestin等和 胚胎干细胞转录因子如So)(2、KIf4、cMyc等，进一步说明其是由未分化的幼稚细 胞构成。在相应药物诱导下，隆突细胞可以定向分化成脂肪细胞、平滑肌细胞、神 经元、施万细胞、骨和软骨等多种细胞类型，可见其很高的多向分化潜能。 结论：皮肤NCSC来源丰富不受限，位置表浅易取材，多向分化运用广，伦 理道德争议小，是比骨髓、脐血等更理想的干细胞来源。我们建立了从毛囊显微 分离、NCSC培养到干细胞表型鉴定、多向分化诱导的一整套技术方法，为皮肤 病基础研究和临床自体移植提供一种全新的干细胞来源。 二、毛囊NCSC的黑素定向分化 白癜风恢复期常见以毛囊为中心的点状色素沉着，同时病理显示有无色素的未 成熟MC从毛囊向表皮迁出；而少毛，无毛部位，复色困难；进一步地，而且移植 正常毛囊至白斑部位可以治疗白癜风：这都提示毛囊在成体皮肤色素系统的修复中 起着重要作用。 我们以毛囊NCSC为种子细胞，经过2．3周的MC方向诱导，分化细胞呈现 类似正常MC的多极树突或双极树突外观，并表达MC特异标志物M ITF和 TYR。更重要的是，分化细胞呈多巴反应阳性，能将无色的L-DOPA转化成棕色 色素颗粒，这就从功能上证实其具有合成黑色素的初步能力。 效率低下一直是困扰MC体外分化的难题。为此，我们反复比较了各种诱导剂 的效果，最后选定了一个含有ET．3、SCF、Wnt3a和TPA等多种成分的“鸡尾 酒”式的复合配方，使得分化效率大幅上调，可达将近40％。 ．4． D D udan 博士研究生学位论文 为研究NCSC---MC分化的调控机制，我们以Realtime PCR动态监测若干重 要分子在分化过程中的时相变化，发现在干细胞“命运决定过程中属于“早期 事件、处于信号通路上游的MITF和TRP．2在诱导后很快激活表达，且表达幅度 也很高；而处于级联反应的下游的TYR和Pmell 7则较晚表达。 结论：皮肤NCSC是表皮和毛发MC的来源，NCSC--,-MC的分化调控是色素 疾病发病和临床干预的潜在靶点。我们从干细胞技术出发，建立了从NCSC—MC 的高效分化方法，并初步研究了调控分化进程的分子机制。该内容为探索色素性 皮肤病的成因和寻找新靶点奠定实验基础，也为临床MC自体移植提供一种便捷的 细胞来源。 三、毛囊NCSC的衰老 衰老是随着年龄增长而发生的组织结构和生理功能的慢性损伤，每个个体均无 法避免、逆转、或者中止。尽管抗衰老研究由来已久，但从干细