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* 第二章蛋白质制备 蛋白质分离纯化的一般程序 蛋白质的粗分离 蛋白质的层析分离 蛋白质的电泳分离 蛋白质的结晶 内 容 提 要 （第二讲） （三）膜蛋白的释放 膜蛋白 外周蛋白 固有蛋白 去污剂 阴离子去污剂 （脱氧胆酸盐） 阳离子去污剂 （溴化十二烷基三甲胺） 两性离子去污剂 非离子型去污剂 （二甲基十二烷基甘氨酸） （TritonX-100） 增溶作用：抽提固有蛋白时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态。 比较理想的增溶剂是去污剂。 3.在低温（-20℃）下，用丙酮处理组织和细菌。 （四）胞外酶的分离 浓缩的方法是超滤。 二、蛋白质的浓缩和脱盐 1.除盐方法： ⑴透析法 ⑵纤维过滤透析法 ⑶分子筛层析法 释放膜蛋白的方法： 1.用磷酸脂酶A消化膜脂肪。 2.在高pH和较高温度下进行超声作用。 容易 稍难 稍难 5h以上 0.5h 数小时 少量或数十毫升 大量样品 少量或数十毫克 透析 纤维过滤透析 分子筛层析 操作难易 操作时间 处理量 方法 蛋白质的脱盐方法比较 2.浓缩的方法 ⑴沉淀法 ⑵吸附到离子交换剂上 ⑶干胶吸附法 ⑷渗透浓缩法 A B 抽真空 超滤液 N2压力 膜 多孔 支板 磁力搅拌器 超滤器 ⑸超滤浓缩法 利用压力或离 心力强行使水 和小分子杂质 通过超滤膜 (一种半透膜) 除去，而蛋白 质留在膜上， 称为超过滤。 超滤法是最近几年发展起来的一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白质。 三、沉淀法分级蛋白质 （一）盐析法 蛋白质 溶液 盐溶现象 盐析现象 加盐 盐浓度低 盐浓度高 在浓盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强 度成正比 ㏒S=㏒S0-KsI 盐析方程式： S-蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度 I-中性盐的离子强度 Ks-盐析常数 S0-蛋白质在无盐溶液中的溶解度 盐析法:加入中性盐，使各种蛋白质依次分别沉淀的方 法． S0-某一蛋白质在特定条件下的溶解度 Ks是盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。 如用β表示S0，盐析方程式可写为： ㏒S=β-KsI 盐析常数Ks代表盐析效率，它是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。 Ks分段盐析法：当盐的种类确定后，在一定pH和温度 条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变盐的I值， 使不同蛋白质分离。 对于同一种蛋白质，盐离子价数越高，盐析能力越强。 PO43-﹥SO42-﹥C2O42-﹥（CHOHCOO-）2﹥AC-﹥Cl-﹥NO3- K+﹥Rb+﹥Na+﹥ Cs+﹥Li+﹥NH4+ Hofmeister序列： β-分段盐析法：在一定的I值下，提高改变pH及温度分 离蛋白质。 蛋白质浓度影 响盐析界限 蛋白质浓度高，盐析界限宽。 蛋白质浓度低，盐析界限窄。 蛋白质浓度在2.5～3.0%之间合适。 求一定体积蛋白质溶液应加饱和硫酸铵的毫升数x： α-所需饱和度（%） V-蛋白质溶液体积 分段盐析：利用不同的蛋白质所带电荷、水化程度 不同，所需盐浓度不同分离。 x= αv 100-α 血浆清蛋白 血浆球蛋白 饱 和 （NH4）2SO4 半 　饱 和 （NH4）2SO4 盐析法优点： 操作简便，使用广泛，中性盐对易变性的蛋白质有保护作用，能除去较多杂质，有纯化作用。 盐析法缺点： 分辨能力差，纯化倍数低。 （二）有机溶剂沉淀法 F-两个带电质点之间的作用力 Q1Q2-两个带电质点电荷量 r-两个带电质点之间的距离 ε-是介电常数 选择有机溶剂的原则： ⑴必须能与水完全混溶； ⑵不与蛋白质发生反应； ⑶要有较好的沉淀效应； ⑷溶剂蒸汽无毒，且不燃烧。 F= εr2 Q1Q2 乙醇和丙酮 使用最广泛 库伦定律 （三）有机聚合物沉淀法 （四）选择性变性沉淀法 有三种方法： 热变性 pH变性 有机溶剂变性 有机溶剂沉淀法比盐析法分辨率高，广泛用于生产 蛋白质制剂。 PEG可沉淀蛋白质，聚丙烯酸可沉淀带正电蛋白质。 分配层析原理（俄国植物学家LiBer1903年提出） 　　混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数。 层析系统 固相 液相 半液相 液相 气相 第三节 蛋白质的层析分离 固定相 流动相 （静相） （动相） 支持物 静相 动相 被分离的物质 一、层析法的一般原理 A B C D E 32 16 16 16 8 8 12 4 12 4 8 2 2 12 8 1 2 3 4 5 阶段 层析柱分离物质示意图 分配定律： 质量分配系数： D=k· Vs Vm Vs-固定相体积 Vm-流动相体积 D﹤1，大多样品留在固相， 样品流速慢； D﹥1，大多样品留在流相， 样品流速快； D=0，样品留在柱顶； D无限大，样品流到柱底； 溶质通过柱的速度决定 于它的质量