实验13-大学琼脂糖凝胶对电泳的原理和方法.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 (4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 1.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系 (1)DNA分子的大小： DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 (2)琼脂糖的浓度： 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示: (2)缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tr