山羊胎儿皮肤黑色说素生成有关mirna的筛选与鉴定-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docx

研究生优秀毕业论文 本研究受到重庆市博士后研究人员科研项目(Xm201335) 本研究受到 重庆市博士后研究人员科研项目(Xm201335) 国家自然科学基金项目 国家自然科学基金(No 中央高校基本业务费专项资金(No．XDJK2014A010) 和2013年重庆高校创新团队建设计划 (No．KJTD20 1334) 的联合资助 万方数据 目录目录 目录 目录 摘要 I Abstract．．．．．．．． ． ．．．． ． ．．．．． ．．．．． ． ． ．．．．．．．．． ．III 第一章文献综述 一1 1．1非编码小分子RNA(non—coding small RNA)研究进展 ．1 1．2小分子RNA的分类及RNA干扰简介 1 1．2．1 siRNA的研究 1 1．2．2 piRNA及其功能研究 2 1．2．3 miRNA简介 ．3 I．2．4 shRNA简介 一4 1．3黑素细胞研究进展 5 1．3．1黑素细胞(melanocytes)的来源 5 1．3．2黑色素生成(melanogenesis)酶 5 1．3．3黑色素生成的调控及信号通路 7 1．3．4 miRNA调控黑色素生成 一7 1．3．5 RNA干扰与黑素瘤 一8 第二章引言 1 1 第三章实验材料和方法 1 3 3．1实验材料 ．．13 3．1．1实验动物 1 3 3．1．2试剂与药品 13 3．1．3主要仪器设备 14 3．2实验方法 一1 5 3．2．1皮肤样品采集、总RNA的提取、文库构建及小RNA测序 15 3．2．2数据的生物信息学分析 15 3．2．3 miRNAs的表达水平分析及miRNAs的差异表达鉴定 ．16 3．2．4 miRNAs的作用靶基因预测及功能分类 一20 万方数据 西南大学硕士学位论文3．2．5 西南大学硕士学位论文 3．2．5 miRNA作用靶基因的验证 21 第四章结果与分析 ．27 4．1黑素颗粒的组织染色鉴定 27 4．2测序结果的生物信息学分析 27 4．3乌皮和白皮山羊胎儿表皮中差异表达miRNA的鉴定 30 4．4差异表达miRNA的Q—PCR鉴定 ．．33 4．5差异表达miRNAs的靶基因预测及鉴定 34 第五章讨论 ．41 5．1关于山羊胎儿皮肤组织的RNA测序结果 41 5．2关于在乌皮和白皮山羊胎儿皮肤组织中差异表达的miRNAs 41 5．3关于差异表达miRNA的靶基因研究 42 5．4小RNA的提取 43 5．5 Solexa测序及山羊miRNA数据库 ．。43 5．6 Q—PCR验证差异表达miRNA 一44 5．7关于miRNA靶基因的预测 44 第六章结论 ．47 参考文献 ．49 附录 ．57 致谢 119 在学期间所发表的文章 121 万方数据 摘要山羊胎儿皮肤黑色素生成有关miRNA的筛 摘要 山羊胎儿皮肤黑色素生成有关miRNA的筛 选与鉴定 动物遗传育种与繁殖专业硕士研究生 孙武 指导老师赵永聚教授 摘 要 黑色素生成是复杂的生理过程，关于肤色形成的机理已经在人类医学和多数 动物上取得了很大的进展，但乌羊的乌皮中乌质性状的形成机理研究相对匮乏。 微小RNA(micro—RNA，miRNA)是一类转录后调控基因表达的、长度约为18-25nt 的内源性单链RNA，属于非编码小分子RNA。研究报道，miRNAs在皮肤细胞 发育、被毛及皮肤颜色控制中起着重要的作用。本研究以皮肤miRNA调控肤色 为核心，对乌皮羊及白皮羊胎儿(100日龄)皮肤组织进行小RNAcDNA文库构 建及Illumina测序，寻找差异表达的miRNAs。 主要研究结果如下： 1．通过对山羊皮肤组织小RNAcDNA文库的测序，得到317个符合miRNA 二级典型结构特点的序列，其中187个序列是在miRBase v20．0．中已报道的山羊 (capra hircus)和绵羊(ovis aries)的miRNAs；60个序列是在miRBase v20。0．0 中有高度同源的候选miRNAs；70个序列在miRBase v20．0中无任何同源序列， 与上述60个miRNAs合并为本研究新发现的miRNAs。这些新的miRNAs中103 个隶属于49个miRNA家族，剩余的miRNA不属于任何家族。对130个新miRNAs 序列进行了系统的命名，明确了其在山羊基因组上的座位及正负链上的位置。 2．本研究采取三个生物学重复，通过三个比较组对比，最终在乌皮羊和白皮 羊100日龄胎儿皮肤中找到了62个差异表达的miRNA，其中31个在乌皮羊胎儿 皮肤中表达上调，另外31个在白皮羊胎儿皮肤中高表达。此外，我们选取10个 差异表达的miRNAs对其进行Q—PCR表达验证，随机检测的3个