蛋白质工先程重点.ppt

* 样品要求 高纯度 高浓度：核磁共振信号的强度与处于谱仪中“灵敏体积”内的样品的量成正比。 稳定 分子量 分子量的增大对核磁共振谱有两方面的影响： (a)??? 谱的复杂程度会增加。 (b)??? 每条谱峰的线宽也会增加。 NMR实验注意点 核磁共振技术优点 可以在溶液中操作，接近生理状态 同样具有高分辨率 分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理 核磁共振技术的不足 样品的分子量要比较小（50KD以下） 对不溶的蛋白比较困难（如膜蛋白） 实验周期长（1年） 电子晶体学 单颗粒冷冻电镜技术 电子断层成像术 电子显微技术 1、电子晶体学 首先必须得到在二维方向上高度有序且足够大的蛋白质二维晶体 其三维重构是通过倾转样品，拍摄不同角度下的电子衍射谱和电子显微像，获取不同转角下的振幅好相位信息，在三维倒易空间中拟合，并加入相应的晶体学对称，通过逆傅里叶变换得到实空间的晶体结构 最大优势：得到的膜蛋白好膜相关的水溶性蛋白在膜环境中的结构信息更反映生理状态下的真实结构。 目前只能对二维晶体结构的样品达到原子或接近原子的分辨率水平 2、冷冻电镜单粒子法 是将样品保存在液氮或液氮温度下利用透射电子显微镜进行二维成像，再经过二维投射图像的分析进行三维重构。 优点 不用结晶 高压快速液氮冷冻包埋，减少了样品在制备过程中的结构破坏，接近生理状态，同时也可减少电子束带来的损伤 场发射抢的使用提高了信噪比 可捕捉不同概念状态的瞬时构象 实时分辨（time-resolution) 3、电子断层成像技术 通过对每一样品每间隔一定角度拍摄一副照片，得到几十副（上百副）代表同一结构不同角度下的二维投影像，然后对这一系列投影像对正，用加权背投影的方法获得样品的空间结构。 显示的是完整结构系统的静态结构信息 面临挑战：冷冻含水技术、超薄切片技术、重复照射 适用于细胞器、细胞结构、或巨大的超分子复合物 在解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系或细胞器的结构上具有优势 电子显微技术的优点 1.可以直接获得分子的形貌信息； 2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品（如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等）； 3.适于捕捉动态结构变化信息； 4.易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息； 5.电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。 一种公认的研究生物大分子、超分子复合体及亚细胞结构的有力手段。目前唯一能研究不同大小和结构的方法。 蛋白质的二级结构预测的基本依据是： 每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。 二级结构预测问题是模式分类问题 二级结构预测的目标： 判断每一段中心的残基是否处于?螺旋、?折叠、转角（或其它状态）之一的二级结构态。 1、二级结构预测概述 蛋白质组学（Proteomics） 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学 同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。 是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁 主要解决问题 基本生物学问题 Post-translational modification Protein-protein interaction Genome-Transcriptome-Proteome 临床应用问题 Disease marker-diagnosis Drug target-therapy 现阶段研究范围及主要内容 ①蛋白质组作用、成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工和修饰分析； ②基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析； ③重要生命活动的分子机制(如细胞周期、分化与发育、环境反应与调节等)； ④医药靶分子的寻找和分析(包括新药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子等)。 技术目标（要求） 有效分离 准确鉴定 合理分析 技术的特点 规模化 通量化 自动化 蛋白质组学研究的手段 蛋白质组研究的核心──用于分离的双向电泳(2 -DE) 蛋白质组技术的支柱———鉴定技术(Identication) 蛋白质组研究的百科全书———数据库(database) 蛋白质组学研究的三大核心技术 激光捕获显微切割（LCM）技术 二维凝胶电泳技术(2 -DE) 生物质谱技术 Laser Capture Micro-dissection，是在直接光学显微观察的基础上，利用激光能量对特定的组织或细胞类型进行切割，同时用激光脉冲所产生的压力把切割后的目的样品弹射(catapult)到收集帽(cap)中富集起来，从而获得均一性的样品。 利