基因芯片技术在慢性髓细胞性白血病分子机制中的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

博士学位论文基因芯片技术在慢性髓细胞性白血病分子 博士学位论文 基因芯片技术在慢性髓细胞性白血病分子 机制中的研究 博士研究生：王蜀燕 指导教师：马文丽教授 摘要 慢性髓细胞性白血痫(Chronicmyeloidleukemia，CML)是血液系统常见的 恶性肿瘤，95％以上的cML临床病人有Ph染色体，即t(9；22)(q34；ql 1)，其分子 生物学本质是9q34的C．abl基因与22qll的bcr基因重组形成bcr／abl融合基因，其翻 译产生的P210蛋白具有明显增高的酪氨酸激酶活性，是致病的主要因素。白血 病的发生和发展是多种相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致。正常 基因突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达以及多个基因的协同作用、基因本 身的多效性和机体免疫因素，决定最终白血病表型的表达与否。 基因芯片技术是近年来分子生物学与微电子学等多学科交融而成的、能够 进行高通量基因表达研究的最新手段，已广泛应用于人类基因研究中。主要包 括芯片探针的制备、载体介质的选择与表面处理、阵列的打印、样品标记与分 子杂交、以及芯片扫描与信息分析等内容。本课题制各了K562细胞基因表达谱 芯片，并应用该自制芯片对药物诱导K562细胞凋亡过程中的基因表达改变进行 了研究：同时应用ABI公司的人全基因组表达谱芯片对慢性髓系自血病的发生 机理进行了初步探讨。 中文摘要研究内容可分为三部分： 中文摘要 研究内容可分为三部分： 1．应用限制性显示PCR技术构建人慢性髓系白血病K562细胞的eDNA文库。 基因表达谱芯片制作的首要问题是快速获取大量的cDNA探针。对逆转录合 成的eDNA进行限制性分组PCR扩增后，同时采用两种方法制备K562细 胞eDNA探针。一是将分组PCR产物进行聚芮烯酰胺凝胶电泳，应用核酸 银染技术分离、显示DNA条带，平均每组有7．10条DNA带，在日光灯下 可以直接切胶回收片段，进行二次PCR扩增及纯化后作为基因芯片探针。 二是将分组PCR产物同T载体连接，构建基因片段文库，共收集800条探 针，长度主要集中在250～750bp之间，并完成了部分探针的测序，其中包括 细胞周期相关基因、细胞代谢途径相关基因、信号转导与转录调控相关基因、 肿瘤相关基因等。 2．探讨了酪氨酸激酶抑制剂(STl571)对K562细胞生长、增殖的影响。本研 究观察到在体外培养的条件下，应用1．0 gmol／L的STl571处理K562细胞 达到一定的时『白J(24h)后，细胞生长明显变缓，出现凋亡细胞的特征：细 胞皱缩、染色质浓集及胞膜起泡，部分细胞胞膜破裂，在其周围有致密的凋 亡小体出现，DNA电泳出现典型的凋亡“梯状”带，证明STl571能有效抑 制K562细胞生长，诱导K562细胞凋亡。利用自制的K562细胞基因表达 谱芯片研究STl571诱导K562细胞凋亡前后的基因表达差异。杂交检测后 发现经STl571诱导后基因表达下调的基因有11个，表达上调的基因有3个。 对这些表达变化的基因功能进行初步分析后发现，主要包括细胞增殖、信号 转导和转录调节，以及抗凋亡基因。其中p27(Kip 1)基因的上调与以往文献 报道一致。 3．应用ABI 1700芯片分析系统研究慢性髓细胞性白血病(CML)的基因表达 的变化。分别从正常人和慢性髓细胞性自血病(cML)病人骨髓样品中抽 取骨髓单个核细胞，分离出eDNA片段，然后再反转录成cRNA并标记后， 与ABI公司的人全基因组表达谱芯片杂交，用1700芯片分析系统分析数 ll 博士学位论文据结果，并通过对部分差异表达的基因在CD40L信号通路中的作用进行分 博士学位论文 据结果，并通过对部分差异表达的基因在CD40L信号通路中的作用进行分 析，探讨差异基因的生物学意义。通过ABI 1700芯片分析系统的数据处理 分析，总共发现差异表达的基因有6706个，其中与CML相关的差异基因 有75个，上调的有19个，下调的有56个；从而论证了ABI 1700：卷片分 析系统在研究基因表达差异中具有极其广泛的应用价值。 关键词 基冈芯片K562细胞STl571 限制性显示PCR基因表达谱差异表达 ABI 1700芯片分析系统 Ill 博士学位论文DNA 博士学位论文 DNA Microarray Study of the Molecular Mechanisms of CML Name： Shuyan Wang Supervisor：Prof．Wenli Ma ABSTRACT Carcinogenesis is a multi—step process involving abnormalities in genomics as well in the expressed genes and prote