互花米草谷胱甘肽合成及还原酶相关基因的克隆和功能鉴定-海洋生物学专业论文.docxVIP

烟台 烟台大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在非保密的论文范围内，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 摘要 盐胁迫是影响植物生长和发育的重要非生物胁迫因子，它能引起次级胁迫-渗透 胁迫和氧化胁迫。植物在胁迫下可以利用抗氧化系统清除活性氧，从而保护细胞和 亚细胞结构。近年来，研究者在盐生植物中鉴定了大量与耐盐相关的基因，并进行 了功能验证。研究表明，谷胱甘肽还原酶 GR 作为抗氧化酶在植物耐盐机制中发挥 了重要作用。 为研究泌盐盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）谷胱甘肽合成酶相关基因 （SaOAS）及还原酶相关基因（SaGRC、SaGRP）的功能，本研究首先分析了互花米 草幼苗在 600 mmol/L NaCl 和 500 μmmol/L CdCl2 胁迫下叶片中谷胱甘肽还原酶 GR 的活性变化；其次，克隆出谷胱甘肽还原酶基因 SaGRC、SaGRP 和半胱氨酸合成酶 基因 SaOAS，构建过量表达载体后利用农杆菌介导法转化拟南芥和水稻，并对获得 的阳性纯合转基因拟南芥株系进行相关生理生化测定和耐盐性分析。实验结果如下： (1) 胁迫处理对谷胱甘肽含量和谷胱甘肽还原酶活性的影响 分别用 600 mmol/L NaCl 和 500 μmmol/L CdCl2 处理互花米草幼苗，结果显示， 随着处理时间的增加，还原性谷胱甘肽含量呈现上升趋势。与此同时，谷胱甘肽还 原酶活性呈现上升趋势，与非变性的聚丙烯酰氨凝胶电泳显示的总体活性相一致。 (2) 基因的克隆和序列分析 利用3’-RACE和5’-RACE技术获得目的基因SaGRC、SaGRP、SaOAS，其中 SaGRC为胞质型，SaGRP为线粒体型，两者序列同源性很高。SaGRC基因的开放阅 读框为1479 bp，推导其编码492个氨基酸残基，SaGRP基因的开放阅读框为1659 bp， 推导其编码532个氨基酸残基。SaOAS基因的开放阅读框为969 bp，推导编码322个氨 基酸残基。 (3) 基因表达水平的变化 分别用 600 mmol/L NaCl 和 500 μmmol/L CdCl2 处理互花米草幼苗，结果显示， SaGRC、SaGRP、SaOAS 基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势，推测 GR 在互 花米草抗逆机制中发挥重要作用。 (4) 转基因拟南芥生理检测 对筛选出的过量 SaGRC、SaGRP、SaOAS 拟南芥株系进行基因表达定量分析， I 万方数据 万方数据 最终分别选取了 2 个株系进行种子萌发、弯根实验，以及相关生理生化指标的测定。 结果显示，在不同浓度的 NaCl 处理下，转基因拟南芥的种子萌发情况优于野生型拟 南芥，转基因株系的丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、还原型谷胱甘肽（GSH）含 量等指标显示，转基因株系的耐盐性比野生型拟南芥有所提高。 (5) 转基因水稻抗性检测 通过植物组织培养法获得的过表水稻出愈率约为 85.4%，分化率约为 23.7%。 其中，对过量表达 SaGRC 基因的水稻 T2 代株系进行定量表达分析和初步表型鉴 定，并选取了 10 个株系进行扩繁，有待得到纯合株系，再进行生理生化指标的测定。 关键词：互花米草；谷胱甘肽；GRC、GRP和OAS基因；盐胁迫；过量表达拟 南芥和水稻 II PAGE III万方数据 PAGE III 万方数据 Abstract Salt stress is one of serious abiotic factors that affect plant growth and development. It could cause secondary stress (osmotic stress) and oxidative stress. Plants can make use of the antioxidant system scavenging reactive oxygen