免疫组化技术常见问题及处理方法.ppt

免疫组化技术常见问题及处理方法 免疫组织化学的定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 免疫组织化学的原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光素等的二抗进行反应 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量 免疫组织化学的分类 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等 SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测 可被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测 免疫组织化学的特点 1）特异性强 2）敏感性高 3）定位准确、形态与功能相结合 Western blotting、ELISA与免疫组化的异同 Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位，但敏感性远远低于免疫组化技术 ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一 免疫组织化学方法的基本步骤 组织和细胞的处理 抗原修复 染色 鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清） 鼠单克隆抗体 特异性较高 背景较干净 有多种潜在用途 但敏感性、亲和力低 兔多克隆抗体（兔抗血清） 高敏感性、亲和力 可能有较多的交叉反应 更多的潜在用途 SP法 1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分钟。 6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。 7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。 8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟。 9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。 二步法(Envision系统) 1）脱蜡、水化组织切片。 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸洗3 分钟×5次。 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 7）应用DAB 溶液显色。 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。 Envision系统的优点 敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单 石蜡切片标本的固定 1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上 如果组织固定不及时或不完全固定,HE