酶工程实验讲义（完整）.doc

实验一 酵母蔗糖酶的提取 一、原理 酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过超声波破碎细胞、硫酸铵沉淀等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶。 二、实验材料、仪器和试剂 1.材料 活性干酵母 2.仪器 (1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)超声破碎仪 3.试剂 (1)1 mol/L醋酸溶液 三、操作步骤 1.破碎细胞 取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。 2.加热除杂蛋白 将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。 3.乙醇沉淀 量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。 用尿糖试纸进行半定量测定： 在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH 4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置10 min，浸入尿糖试纸，1 s后取出，60 s后比较颜色的深浅，与比色卡对照。 尿糖试纸的原理： 尿糖试纸是将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶及无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧；原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。当这种酶试纸与溶液（或尿液）相遇时，很快就会因溶液（或尿液）中葡萄糖含量的由少到多而依次呈现出浅蓝、浅绿、棕或深棕色。尿糖试纸是固定化酶实际应用的范例之一。 四、结果分析 以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活、NaCl浓度为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。 实验二 蔗糖酶酶学性质的研究 1 pH对蔗糖酶活动性的影响 酶的生物学特性之一是它对酸碱度的敏感性，pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适PH。 酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如： H＋ H＋ EH2＋ ＋ EH E－ pKa1 (有活性) pKa2 酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。 蔗糖酶有两组离子化活性基团，它们均影响酶水解蔗糖的能力。其解离常数分别是 pKa =7和pKa =3。 实验方法： 按下表配制7种缓冲溶液（公用）： 将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。 溶液pH 缓冲试剂 体积ml 缓冲试剂 体积ml 2.5 0.2mol/L磷酸氢二钠 2.00 0.2mol/L柠檬酸 8.00 3.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 3.65 0.2mol/L柠檬酸 6.35 4.0 0.2mol/L乙酸钠 1.80 0.2mol/L乙酸 8.20 5.0 0.2mol/L乙酸钠 7.00 0.2mol/L乙酸 3.00 6.0 0.2mol/L乙酸钠 9.50 0.2mol/L乙酸 0.50 7.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 6.10 0