分子生命物学实验.pptVIP

基因组DNA的提取（哺乳动物基因组DNA的分离及定性定量分析） 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。 利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。 在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 提纯的思路 基因组DNA的特性：分子量较大、易断（如何保证DNA分子的完整性？） 2. 组织和细胞的破碎 3. 要去除的物质： 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质 四、实验步骤 基因组DNA的提取： 0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 ? 加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL匀浆液混匀 ? 匀浆液转入2mL小指管，40C , 5000rpm离心2min, ? 沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀 ? 550C 水浴酶解过夜或2小时以上，40C存放 ? 基因组DNA的检测 前述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。 1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 (☆) 2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上80V电泳, 检测DNA的分子大小。 (☆) 3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。 可能的结果： 实验的常见问题、关键问题及难点： 基因组DNA的断裂、 蛋白和色素去除不干净 基因组DNA难溶、电泳时凝胶易碎 * * 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以动物肝脏为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管 高速冷冻离心机 台式离心机 水浴锅。 三、试剂： 1. 组织匀浆液 200 mL 灭菌备用 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl 2. 酶解液 100 mL （灭菌后再加蛋白酶K和SDS) 20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/mL蛋白酶K 1％SDS 3. 生理盐水(0.7%) 1000 mL 灭菌备用 4. 3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 灭菌备用 先用50mL水溶解固体NaAc 再用3mol/L乙酸调pH至5.2，最后定容 同时灭菌备用： 枪头： 1mL 、200uL 各一盒 小指管: 2.0、0.5mL各20个 研磨棒: 20支 无菌水