iTRAQ定量蛋白质组学.pptVIP

客户关注的信号通路（pathway） 差异表达蛋白相互作用网络分析 利用MetaCore软件，对所有显著差异表达蛋白进行相互作用网络分析，。相互作用网络分析显示，差异表达蛋白富集到30条经典子网络，右为包含“SP1, TRAP230, Neprilysin, MIF, SLC38A2”等关键节点的子网。 总结 总结：iTRAQ技术及后期分析可以帮助客户很好地验证试验猜想，以及为揭示蛋白表达变化原因提供可靠的方向指引。 高阶（客制化）信息分析 详见信息分析PDF iTRAQ详细实验步骤—ABI试剂盒 iTRAQ详细实验步骤 1：蛋白质提取 可以选择提取蛋白质常用的各种溶液，裂解液里最好不要包括下面试剂，因为这些试剂会干扰iTRAQ试剂的标记反应。 iTRAQ详细实验步骤 2：蛋白质定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS-APGE电泳，银染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。 iTRAQ详细实验步骤 3：酶切，标记 每组样本（各100μg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20℃沉淀30min~4h（根据样品所需沉淀量选择时间，一般开始时可选1小时）； 12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer（20μL） 和1% SDS(1μL)充分混悬溶解样品； 加入还原试剂2μL，混匀，60 ℃反应1h； 加入半胱氨酸封闭试剂（cystine blocking regent）1μL,室温处理10分钟； 按照酶：蛋白质=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）； 113,114,115,116,117,118,119,121各管标记试剂中加入50μL异丙醇(试剂盒中自带），混匀，分别加入各管样品中，室温反应1h，之后各加入3倍体积的水，使标记试剂分解。标记和样品对应关系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121； 合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。 iTRAQ详细实验步骤 4： 除盐，此步操作是将标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐除去，以便于后续分析。 （1）100%乙腈冲洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次 （3）用400uL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上 （4）0.1%TFA 冲洗柱子3~5次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA 400μL洗脱下样品 （6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。 iTRAQ详细实验步骤 5: 第一维强阳离子柱(SCX)分离 （1）仪器及试剂： 1 色谱仪20AD(岛津) 2 真空离心浓缩机(Christ RVC 2-25，Christ，Germany) 3 磷酸二氢钾(国药集团) 4 氯化钾(国药集团) 5 乙腈ACN(Fisher) （2）具体操作参数 柱子信息：Polysulfoethyl column,2.1mm*100mm,5u,200A, The Nest Group,Inc.MA A相：10mM KH2PO4，25% CAN，PH 2.6 B相：10mM KH2PO4，350mM KCl，25%ACN，PH 2.6 紫外检测波长：214nm/280nm 流速：200μL/min 梯度：60min B%从5分钟5%到40分钟上升至25% Time(min) B% 0 0 5 5 40 25 45 80 50 80 51 0 60 stop 根据峰型和时间共收取20个梯度,真空离心浓缩后，用50μL RPLC A相[5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)]溶解，进行第二维分析。 iTRAQ详细实验步骤 6: 第二维反相液质联用RPLC-MS （1）仪器及试剂 1 色谱仪20AD(岛津) 2质谱仪 QSTAR XL（Applied Biosystem,USA） 3乙腈ACN(Fisher) 4甲酸（TEDIA） （2）具体操作参数 反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 μm, 300A